Boncuk yükleme, membran, geçirimsiz parçacıkları canlı yapışkan hücrelere yüklemek için ucuz bir testtir. Bu protokol, tek hücre veya tek bir molekül veya floresan mikroskopi deneyleri için probları yüklemek için son derece yararlı olduğunu kanıtlamıştır. Boncuk yükleme, araştırmacıların proteinler, DNA, RNA, sentetik parçacıklar veya bunların bir kombinasyonu da dahil olmak üzere her türlü molekülü aynı anda tek hücrelere hızlı bir şekilde yüklemelerini sağlar.
Boncuk yüklemesini ilk gerçekleştirirken, dokunma kuvvetini test etmek önemlidir. Hücre hatları boncuk yüklemesine farklı yanıt verir. Böylece muslukların sayısı ve kuvveti, hücre tavlamayı en aza indirirken optimum hücre yüklemesi için değiştirilebilir.
Matthew Saxton ve ben prosedürümüzü göstermek için meslektaşlarımız Dr. Amanda Cook ve Gabriel Galindo ile birlikte olacağız. 50 mililitrelik konik bir tüpte yaklaşık beş mililitre cam boncuk ölçerek başlayın. Tüpe 25 mililitre iki azı dişi sodyum hidroksit ekleyin ve bir çalkalayıcı veya rotor kullanarak iki saat boyunca hafifçe karıştırın.
Boncuklar süspansiyondaysa, boncuk tüpünü bir santrifüjde kısa bir süre döndürün, ardından mümkün olduğunca çok boncuk tutarken sodyum hidroksitini deklare edin. Boncukları hücre kültürü sınıfı su ile pH nötr olana kadar iyice yıkayın ve suyu her seferinde demlendirin. Nötr bir pH'ı onaylamak için atık üzerindeki pH test şeridini kullanın, ardından boncukları iki ila üç kez% 100 etanol ile iyice yıkayın.
Her seferinde etanol dekante ediyor. Boncukları kurutun ve steril bir kabın içinde ince bir tabaka oluşturmak için serpin. Daha sonra kabı, boncukları bir gecede havayla kurutmak için bir biyogüvenlik kabininin içinde açık bırakın.
Kabı hafifçe dokunun veya sallayın ve boncukların tamamen kuru olduğundan emin olmak için topaklanmadan veya pullanmadan kumlu bir dokuya sahip olup olmadığını kontrol edin. Boncukları aparatlara ekleyin ve boncukların geçmesine izin vermek için bir polipropilen ağ veya eşdeğer bir malzeme kullanarak boncuk tutma odasının tüm açıklığı 105 mikrometre açıklıkla kaplar. Örgüyu metal yeniden kullanılabilir bir görüntüleme odasının erkek ve dişi uçları arasında sıkıştırın, ardından mumsu filmle sıkıca kapatın ve UV cihazı 15 dakika sterilize edin.
Boncuk yükleyici aparatı artık yüzlerce yükleme tahlilini gerçekleştirmek için kullanılabilir. Cihazı silika jel veya diğer kurutucu ortam tarafından kurutulan kuru bir kapta saklayın ve kapatın. Boncuklar dökülürse, boncuk yükleyicisini iyice kurutun ve sterilize edin ve daha önce gösterildiği gibi taze boncuklarla değiştirin.
Ortamı hücrelerden çıkarın ve odanın kenarlarından tüm ortamı hafifçe epire edin. Daha sonra hazneyi yaklaşık 45 derecelik bir açıyla eğin ve orta mikro kuyuda kalan ortam damlasını çıkarın. Pipet boncuk yükleme çözeltisi, odanın merkezinde bulunan cam mikro kuyuya hafifçe yüklenir.
Hücrelerin üzerine bir monolayer cam boncuk hafifçe dağıtmak için boncuk yükleme aparatı kullanın. Boncukların hücreleri tamamen kaplağından emin olun. Odayı iki parmağınızla kıstırın, iki inç civarında kaldırın ve kabı bu yükseklikten düşürmeye yaklaşık eşdeğer bir kuvvet kullanarak sıkıca aşağı indirin, yavaşça odanın plastik tarafına pipetleyerek ortamı odaya geri ekleyin.
Hücreleri rahatsız etmeden yüzen boncukları aspire edin, tüm boncuk yükleme prosedürü nispeten hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Böylece hücreler orta olmadan kurumadan kururlar. Daha sonra inkübatörde hücreleri 4,5 ila iki saat kuluçkaya yatırın.
Görüntülemeden önce, yükleme çözeltislerindeki boncukları ve fazla yükleme bileşenlerini çıkarmak için hücreleri ortamla üç kez yıkayın. Metin el yazmasındaki talimatları kullanarak hücreleri hemen veya deney tarafından gerekli olduğunda görüntüleyin. Başarılı bir şekilde boncuk yüklenen hücreler, neredeyse her zaman Cy3-Pa57 ve A488-H3K11ac proteinleri birlikte etiketledi.
Bir mikrogram plazmid DNA ve kodlama GFP ve 0,5 mikrogram Cy3 etiketli protein de ifade edilen ve görselleştirilen boncuk yüklemesi ile hücrelere sokuldu. Hücrelerin %40'ı fab protein yüklü boncuk, boncuk yüklü hücrelerin %21'i çekirdek yüklü Plazmid'i ifade ediyordu. Boncuk yüklü hücreler farklı plazmid seviyelerini ifade etti.
Fisher oran testinin sonucu, bir ve iki proteinin benzer yoğunluk dağılımlarına sahip olmasına rağmen, her proteinin plazmidden önemli ölçüde daha küçük bir dağılıma sahip olduğunu göstermiştir. Boncuk yüklü proteinlerin seviyeleri hücreden hücreye çok az varyansa sahipti ve aynı anda yüklenen iki proteinin seviyeleri birbiriyle oldukça ilişkiliydi. Uygun boncuk yüklemesi, boncuk yüklemesinden hemen önce, doğrudan sonra ve 24 saat sonra görüntülendiğinde insan U2OS hücrelerinin sayısı veya morfolojileri üzerinde neredeyse hiçbir belirgin etkiye sahip değildi.
Aşırı boncuk ve dokunma kuvveti ile zayıf boncuk yüklemesi hücre kaybına, zayıf hücre morfolojisi ve kapak camında kalan boncuk kümelerine neden oldu. boncuk yükleme sırasında hücrelerin mekanik hasara uğradığı düşünülse de, hücreler düzgün boncuk yüklü odada büyüdü ve çoğaldı. Boncuk yüklü hücrelerin hücre bölünmesine uğradığı da gözlendi.
RPE1 ve hela hücre hatları, boncuk yükleme tekniğinin çok yönlülüğünü göstermek için fab ile yüklendi. U2OS hücreleri ayrıca Cy5-RNA 9-mer ve Cy3-DNA 28-mer ile dolu boncuklardı. Bu protokol denenirken, çok fazla boncuk hücrelerin ayırmasına neden olduğundan, hücrelere yalnızca bir tek katmanlı boncuk eklemeyi sağlayın.
Bu nedenle, boncuk yükleme hücrelerine kısa bir 30 dakikalık kurtarma sonrası, prosedür boyama gibi daha fazla adım gerektiriyorsa, iyileşme döneminden sonra da yapılabilir, hemen veya saatler ila günler sonra görüntülemeye hazırdır.
