O carregamento de contas é um ensaio barato para carregar membrana, partículas impermeáveis em células aderentes vivas. Este protocolo provou ser extremamente útil para carregar sondas para uma única célula ou uma única molécula ou experimentos de microscopia de fluorescência. O carregamento de contas permite que os pesquisadores carreguem rapidamente todos os tipos de moléculas, incluindo proteínas, DNA, RNA, partículas sintéticas ou uma combinação delas simultaneamente em células únicas.
Ao realizar o carregamento de contas pela primeira vez, é importante testar a força de toque. As linhas celulares respondem de forma diferente ao carregamento de contas. E assim o número e a força das torneiras podem ser modificados para o carregamento ideal da célula, minimizando o pealing celular.
Para demonstrar o procedimento Matthew Saxton e eu estaremos acompanhados por nossos colegas, Dr. Amanda Cook e Gabriel Galindo. Comece medindo aproximadamente cinco mililitros de contas de vidro em um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione 25 mililitros de dois hidróxido de sódio molar ao tubo e misture delicadamente por duas horas usando um agitador ou um rotor.
Gire o tubo de contas brevemente em uma centrífuga se as contas estiverem suspensas, em seguida, decantar o hidróxido de sódio enquanto retém o máximo de contas possível. Lave as contas cuidadosamente com água de grau de cultura celular até que o pH seja neutro e decante a água todas as vezes. Use a tira de teste de pH no efluente para confirmar um pH neutro e depois lave as contas bem com 100% de etanol, duas a três vezes.
Decantando o etanol todas as vezes. Seque as contas e polvilhe-as para formar uma camada fina dentro de um recipiente estéril. Em seguida, deixe o recipiente aberto dentro de um armário de biossegurança para secar as contas durante a noite.
Bata suavemente ou agite o recipiente e verifique se as contas têm uma textura Sandy sem aglomeração ou descamação para garantir que as contas estejam completamente secas. Adicione as contas ao aparelho e cubra toda a abertura da câmara de retenção de contas usando uma malha de polipropileno ou material equivalente com aberturas de 105 micrômetros para permitir que as contas passem. Fixar a malha entre as extremidades masculina e feminina de uma câmara de imagem reutilizável metálica, em seguida, selá-la firmemente com o filme ceroso e UV esterilizar o aparelho por 15 minutos.
O aparelho de carregador de contas agora pode ser usado para realizar centenas de ensaios de carregamento. Armazene o aparelho em um recipiente seco dessecado por gel de sílica ou outro meio dessecante e selá-lo. Se as contas se tornarem despejar completamente secas e esterilizar o carregador de contas e substituí-lo por contas frescas, como demonstrado anteriormente.
Remova o meio das células e aspire suavemente todos os meios ao redor das bordas da câmara. Em seguida, incline a câmara em aproximadamente um ângulo de 45 graus e remova a gota restante de mídia no micro poço central. Pipeta a solução de carregamento de contas suavemente sobre o micro de vidro bem presente no centro da câmara.
Use o aparelho de carregamento de contas para dispersar suavemente uma monocamada de contas de vidro em cima das células. Certifique-se de que as contas cobrem completamente as células. Aperte a câmara com dois dedos, levante-a em torno de duas polegadas e traga-a firmemente para baixo usando uma força aproximadamente equivalente a deixar o prato dessa altura suavemente adicionar o meio de volta para a câmara, pipetando lentamente para o lado plástico da câmara.
Aspirar quaisquer contas flutuantes sem perturbar as células, todo o procedimento de carregamento de contas deve ser realizado relativamente rapidamente. Assim, as células não secam quando estão sem meio. Em seguida, incubar as células de 4,5 a duas horas na incubadora.
Antes de fotografar, lave as células três vezes com o meio para remover contas e componentes de carregamento excessivos na solução de carregamento. Imagem as células imediatamente ou quando exigido pelo experimento usando instruções no manuscrito de texto. Células que foram carregadas com sucesso, quase sempre tinham Cy3-Pa57 e A488-H3K11ac rotuladas as proteínas juntas.
Um micrograma de DNA plasmídeo e codificação GFP e 0,5 microgramas de proteína rotulada Cy3 também foi introduzido nas células através do carregamento de contas expresso e visualizado. 40% das células eram repletas de proteína fab e 21% das células carregadas de contas expressam o núcleo carregado plasmid. As células carregadas de contas expressavam diferentes níveis de plasmídeo.
O resultado desse teste de razão de Fisher mostrou que, embora as proteínas um e dois tivessem distribuições de intensidade semelhantes, cada proteína tinha uma distribuição significativamente menor do que o plasmídeo. Os níveis de proteínas carregadas de contas tinham pouca variância celular para célula e os níveis de duas proteínas carregadas simultaneamente estavam altamente correlacionados entre si. O carregamento adequado de contas não teve quase nenhum efeito perceptível no número de células U2OS humanas ou sua morfologia quando imagens diretamente antes, diretamente depois e 24 horas após o carregamento de contas.
O mau carregamento de contas com contas excessivas e força de toque causou perda celular, morfologia celular ruim e agrupamentos de contas remanescentes no vidro de cobertura. embora as células sejam consideradas submetidas a danos mecânicos durante as células de carregamento de contas cresceram e proliferaram na câmara devidamente carregada de contas. Observou-se também que as células carregadas de contas, submetidas à divisão celular.
As linhas celulares RPE1 e heLa foram carregadas com fab para demonstrar a versatilidade da técnica de carregamento de contas. As células U2OS também foram carregadas com um Cy5-RNA 9-mer, e Cy3-DNA 28-mer juntos. Ao tentar este protocolo, certifique-se de adicionar apenas uma monocamada de contas às células, já que muitas contas fazem com que as células se desprendem.
Assim, depois de um breve post de recuperação de 30 minutos para células de carregamento de contas estão prontos para imagens imediatamente ou horas depois, se o procedimento exigir outras etapas, como a coloração, que pode ser feito após o período de recuperação também.
