Il caricamento di perle è un test economico per il caricamento di membrane, particelle impermeabili in cellule aderenti vive. Questo protocollo si è dimostrato estremamente utile per il caricamento di sonde per esperimenti di microscopia a singola cellula o a singola molecola o a fluorescenza. Il caricamento di perle consente ai ricercatori di caricare rapidamente tutti i tipi di molecole, tra cui proteine, DNA, RNA, particelle sintetiche o una combinazione di queste contemporaneamente in singole cellule.
Quando si esegue per la prima volta il caricamento delle pere, è importante testare la forza di maschiatura. Le linee cellulari rispondono in modo diverso al caricamento delle perline. E così il numero e la forza dei rubinetti possono essere modificati per un carico ottimale delle celle riducendo al minimo il pealing delle celle.
Per dimostrare la procedura Matthew Saxton e io saremo raggiunti dai nostri colleghi, Dr.Amanda Cook e Gabriel Galindo. Inizia misurando circa cinque millilitri di perle di vetro in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 25 millilitri di due idrossido di sodio molare al tubo e mescolare delicatamente per due ore usando uno shaker o un rotore.
Girare brevemente il tubo di perle in una centrifuga se le perle sono in sospensione, quindi decantare l'idrossido di sodio mantenendo il maggior numero possibile di perle. Lavare accuratamente le pere con acqua di coltura cellulare fino a quando il pH è neutro e decantare l'acqua ogni volta. Utilizzare la striscia reattiva del pH sull'effluente per confermare un pH neutro, quindi lavare accuratamente le perline con etanolo al 100%, due o tre volte.
Decantare l'etanolo ogni volta. Asciugare le perle e cospargerle per formare uno strato sottile all'interno di un contenitore sterile. Quindi lasciare il contenitore aperto all'interno di un armadietto di biosicurezza per asciugare all'aria le perle durante la notte.
Picchiettare o scuotere delicatamente il contenitore e controllare che le perle abbiano una consistenza sabbiosa senza aggregarsi o sfaldarsi per assicurarsi che le perle siano completamente asciutte. Aggiungere le perline all'apparecchio e coprire l'intera apertura della camera di tenuta del perline utilizzando una rete di polipropilene o materiale equivalente con aperture di 105 micrometri per consentire il passaggio delle perline. Bloccare la rete tra le estremità maschio e femmina di una camera di imaging riutilizzabile in metallo, quindi sigillarla saldamente con la pellicola cerosa e sterilizzare UV l'apparecchio per 15 minuti.
L'apparato caricatore di perle può ora essere utilizzato per eseguire centinaia di saggi di carico. Conservare l'apparecchio in un contenitore asciutto essiccato con gel di silice o altro mezzo essiccante e sigillarlo. Se le perle si scaricano completamente asciutte e sterilizzano il caricatore di perle e sostituirlo con perle fresche, come dimostrato in precedenza.
Rimuovere il mezzo dalle celle e aspirare delicatamente tutto il mezzo da intorno ai bordi della camera. Quindi inclinare la camera con un angolo di circa 45 gradi e rimuovere la goccia rimanente di materiale nel micro pozzesso centrale. Pipettare delicatamente la soluzione di carico del perlo sul micro pozzo di vetro presente al centro della camera.
Utilizzare l'apparato di carico delle perle per disperdere delicatamente un monostrato di perle di vetro sopra le celle. Assicurarsi che le pere coprano completamente le cellule. Pizzicare la camera con due dita, sollevarla di circa due pollici e portarla verso il basso con una forza approssimativamente equivalente a far cadere il piatto da quell'altezza aggiungere delicatamente il mezzo nella camera pipettando lentamente sul lato di plastica della camera.
Aspirare eventuali perli galleggianti senza disturbare le cellule, l'intera procedura di caricamento delle perture deve essere eseguita in tempi relativamente brevi. Quindi le cellule non si asciugano quando sono senza mezzo. Quindi incubare le cellule da 4,5 a due ore nell'incubatrice.
Prima dell'imaging lavare le celle tre volte con il mezzo per rimuovere le perle e i componenti di carico in eccesso nella soluzione di carico. Immagina le celle immediatamente o quando richiesto dall'esperimento usando le istruzioni nel manoscritto di testo. Le cellule che sono state caricate con successo, quasi sempre avevano Cy3-Pa57 e A488-H3K11ac etichettato le proteine insieme.
Un microgrammo di DNA plasmidico e GFP codificante e 0,5 microgrammi di proteina etichettata Cy3 è stato anche introdotto nelle cellule tramite carico di perle espresso e visualizzato. Il 40% delle cellule sono state caricate con proteine favolose e il 21% delle cellule caricate con perle esprimono il nucleo caricato Plasmid. Le celle caricate con perle esprimevano diversi livelli di plasmide.
Il risultato di quel test del rapporto di Fisher ha mostrato che, sebbene le proteine uno e due avessero distribuzioni di intensità simili, ogni proteina aveva una distribuzione significativamente più piccola rispetto al plasmide. I livelli di proteine caricate con perle avevano poca varianza da cellula a cellula e i livelli di due proteine caricate simultaneamente erano altamente correlati tra loro. Il corretto caricamento delle perle non ha avuto quasi alcun effetto evidente sul numero di cellule U2OS umane o sulla loro morfologia quando ripreso direttamente prima, direttamente dopo e 24 ore dopo il caricamento delle perle.
Lo scarso carico di perle con perle eccessive e la forza di spillatura hanno causato la perdita di cellule, la scarsa morfologia cellulare e gruppi di perle rimanenti sul vetro di copertura. anche se si pensa che le cellule subiscano danni meccanici durante il caricamento delle perle, le celle sono cresciute e proliferate nella camera caricata correttamente con perle. È stato anche osservato che le celle caricate con perla subiscono la divisione cellulare.
Le linee di celle RPE1 e HeLa sono state caricate con fab per dimostrare la versatilità della tecnica di caricamento delle perline. Le cellule U2OS sono state anche caricate con un Cy5-RNA 9-mer e Cy3-DNA 28-mer insieme. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi di aggiungere solo un monostrato di perle alle cellule poiché troppe perle causano il distacco delle cellule.
Quindi, dopo un breve post di recupero di 30 minuti per il caricamento delle perle, le cellule sono pronte per l'imaging immediatamente o ore o giorni dopo, se la procedura richiede ulteriori passaggi come la colorazione, che può essere fatto anche dopo il periodo di recupero.
