ビーズローディングは、膜、不透過性粒子を生きた付着細胞にロードするための安価なアッセイです。このプロトコルは、単一細胞または単一分子または蛍光顕微鏡実験のためのプローブの積み込みに非常に有用であることが証明されている。ビーズローディングにより、研究者はタンパク質、DNA、RNA、合成粒子、またはこれらを同時に組み合わせたあらゆる種類の分子を単一細胞に素早くロードすることができます。
初めてビーズのロードを行うときは、タップ力をテストすることが重要です。セルラインは、ビードのロードに対して異なる反応を示します。そして、タップの数と力は、細胞のピーリングを最小限に抑えながら、最適な細胞負荷のために変更することができます。
手順を実証するために、マシュー・サクストンと私は同僚、アマンダ・クック博士とガブリエル・ガリンドが参加します。50ミリリットル円錐形チューブ内の約5ミリリットルのガラスビーズを測定します。25ミリリットルの水酸化モルナトリウムをチューブに加え、シェーカーまたはローターを使用して2時間やさしく混ぜます。
ビーズが懸濁している場合は遠心分離機でビーズのチューブを短時間回転させ、できるだけ多くのビーズを保持しながら水酸化ナトリウムをデカントします。pHが中性になるまで細胞培養グレードの水でビーズを十分に洗い、毎回水をデカントします。廃液にpH試験ストリップを使用して中性pHを確認し、100%エタノールで2〜3回ビーズを十分に洗います。
エタノールを毎回デカントする。ビーズを乾燥させ、それらを振りかけ、滅菌容器の中に薄い層を形成します。その後、容器をバイオセーフティキャビネットの中に開けて、ビーズを一晩空気乾燥させます。
容器を軽くタップまたは振り、ビーズが完全に乾燥していることを確認するために、束やフレークなしで砂質のテクスチャを持っていることを確認します。ビーズを装置に追加し、105マイクロメートルの開口部を有するポリプロピレンメッシュまたは同等の材料を使用してビーズ保持室の開口部全体を覆い、ビーズが通過できるようにします。金属再利用可能なイメージングチャンバーの男性と女性の端の間にメッシュをクランプし、ワックス状のフィルムでしっかりと密封し、15分間装置をUV殺菌します。
ビーズローダー装置は、何百ものローディングアッセイを実行するために使用できるようになりました。装置をシリカゲルまたは他の乾燥剤媒体で乾燥させた乾燥容器に保管し、密封する。ビーズがダンプに完全に乾燥し、前に示したように、ビードローダーを殺菌し、新鮮なビーズに交換した場合。
細胞から培地を取り出し、チャンバーの端の周りからすべての媒体を穏やかに吸引します。その後、チャンバーを約45度の角度で傾け、中央のマイクロウェル内の残りのメディアドロップを取り除きます。チャンバーの中央に存在するガラスマイクロウェルにそっとビーズローディング溶液をピペット。
ビーズローディング装置を使用して、ガラスビーズの単層を細胞の上に優しく分散させます。ビーズが細胞を完全に覆っていることを確認します。チャンバーを2本の指でつまみ、2インチ前後で持ち上げ、その高さから皿を落とすのとほぼ同等の力を使ってしっかりと下げ、チャンバーのプラスチック側にゆっくりとピペットを入れてチャンバーにゆっくりと入れ込みます。
細胞を乱すことなく浮遊ビーズを吸引し、ビーズの装填手順全体を比較的迅速に行う必要があります。したがって、細胞は培地がないときに乾燥しません。その後、インキュベーターで細胞を4.5〜2時間インキュベートする。
イメージングする前に、細胞を媒体で3回洗浄し、ローディング溶液中のビーズおよび過剰な負荷成分を除去する。テキスト原稿の指示を使用して、すぐに、または実験で必要な場合にセルを画像化します。正常にビーズをロードした細胞は、ほとんどの場合、Cy3-Pa57とA488-H3K11acを一緒に標識した。
プラスミドDNAとコードGFPの1マイクログラムと0.5マイクログラムのCy3標識タンパク質も、発現および可視化されたビーズローディングを介して細胞に導入された。細胞の40%は、ファブタンパク質を装填したビーズであり、21%のビーズを装填した細胞は、コアをロードしたプラスミドを発現する。ビーズを装填した細胞は、様々なレベルのプラスミドを発現した。
そのフィッシャー比検定の結果、タンパク質1と2は同様の強度分布を持っていたが、各タンパク質はプラスミドよりも有意に小さい分布を持つことが示された。ビーズをロードしたタンパク質のレベルは細胞分散に対してほとんどなく、同時にロードされた2つのタンパク質のレベルは互いに高い相関を持っていました。適切なビーズのロードは、ビードローディングの直後、直後、24時間後に画像化されたヒトU2OS細胞の数またはその形態にほとんど顕著な影響を及ぼさなかった。
過剰なビーズとタッピング力で貧弱なビーズの負荷は、細胞の損失、貧しい細胞形態およびカバーガラスに残っているビーズのクラスターを引き起こしました。ビーズローディング中に細胞が機械的損傷を受けると考えられているにもかかわらず、細胞は成長し、適切にビーズを積んだチャンバーで増殖した。また、ビーズが細胞を装填し、細胞分裂を受けることも観察された。
RPE1とHeLa細胞株は、ビーズローディング技術の汎用性を実証するためにファブをロードしたビーズでした。U2OS細胞はまた、Cy5-RNA 9-mer、およびCy3-DNA 28-merを一緒にロードしたビーズを含んでいた。このプロトコルを試みるとき、ビーズのモノレイヤーのみをセルに追加する必要があります。
したがって、ビーズローディングセルへの短い30分の回復ポストの後、すぐにまたは数時間後にイメージングする準備ができている場合、手順が染色などのさらなるステップを必要とする場合は、回復期間の後にも行うことができます。
