该协议使我们能够可视化由ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA第二次重组的变化。DNA结构的变化可能与转录调控相关。这是一种简单且高度敏感的技术,它使用非常少量的纯DNA来记录寡核苷酸的结构变化。
该方法可以深入了解由ATP依赖性染色质重塑蛋白介导的转录调控。首先,新鲜制备缓冲液和其他反应组分的工作浓度,并在设置反应之前将它们保持在四摄氏度,然后使用NADH偶联氧化测定法在不同DNA分子存在下测量蛋白质的ATP酶活性。将0.1毫摩尔ADAAD,2毫摩尔ATP,10纳摩尔DNA和1X REG缓冲液在96孔板中混合至最终体积为250微升。
接下来,在37摄氏度的培养箱中孵育反应30分钟,然后使用与酶标仪一起提供的软件测量NAD +的量。要测量340纳米处的吸光度,请单击NADH测定并将96孔板放在仪器中的板架上,然后单击读取板按钮以记录吸光度。在高透明度石英比色皿中收集CD光谱。
使用矩形或圆柱形比色皿。要清洁比色皿,请用水清洗几次,然后扫描比色皿中的水或缓冲液以检查其是否干净。对于反应,使用PAGE纯化的DNA寡核苷酸。
为了快速冷却,在加热块上将DNA在94摄氏度下加热三分钟,然后立即在冰上冷却。对于缓慢冷却,在将DNA加热到94摄氏度三分钟后,让它以每分钟一摄氏度的速度冷却到室温。为了记录基线光谱,在1.5毫升离心管中逐个设置总共五个对照反应。
在所有反应中将反应体积保持在300微升。为了记录CD光谱,在1.5毫升离心管中逐个设置总共五个实验反应。要记录扫描,请打开气体并打开CD光谱仪。
10到15分钟后,打开灯,打开水浴,并将支架温度设置为37摄氏度。接下来,打开CD光谱软件,将温度设置为37摄氏度,波长范围在180至300纳米,每个点的时间为0.5秒,扫描编号设置为5,然后单击pro数据查看器,制作一个新文件,并使用实验的详细信息和日期对其进行重命名。接下来,通过移液混合基线和实验反应,并小心地将反应混合物逐个转移到比色皿中,确保没有气泡。
如果进行时间过程实验,请在37摄氏度下孵育反应所需的时间,然后进行扫描。将EDTA加入含有DNA,ATP,镁和蛋白质的缓冲液中以阻止ATP水解。为了完全抑制ATP酶活性,增加EDTA浓度和孵育时间。
从软件中的相应反应中减去基线,并在CD光谱软件或数据绘图软件中平滑数据,然后绘制波长与平均残差椭圆度的图表并分析峰值。M-folds表明MYC DNA的两条链都可以形成茎环状结构。这里显示了包含G四链体GECE的正向和反向DNA序列的M折叠结构。
在ATP和ADAAD不存在和存在的情况下,快速冷却的GECE的CD光谱表明,ADAAD诱导了两个正峰,一个在258纳米处,另一个在210纳米处。EDTA的加入废除了这种构象变化。CD光谱现在有一个负210纳米的峰值和一个宽的正波段,峰值在230和250纳米。
QGRS映射器和M折叠分析表明,DROSHA,DGCR8和DICER的启动子区域具有形成G四链体和茎状结构的潜力。DROSHA对5的CD光谱显示,ADAAD在210纳米处诱导负峰,在260纳米处诱导正峰。该光谱是ADNA的特征。
DGCR8对一的CD光谱在210纳米处显示正峰,在260纳米处显示宽负峰。该谱是B到X过渡的特征。对于DGCR8对7,在210纳米和270纳米处看到了强烈的正峰,在250纳米处看到了负峰。
该光谱是平行G四链体DNA结构的特征。最后,对于DICER对一,在210纳米处观察到一个正峰和两个负峰,一个在230纳米处,另一个在260纳米处。这些峰是A到X DNA过渡的特征。
确保DNA和蛋白质的纯度为99%以上。比色皿应干净,基线应小于一百分之一。所有试剂应为纯正,使背景小于一毫微。