El protocolo nos permite visualizar los cambios en la segunda reestructuración del ADN inducidos por las proteínas remodeladoras de cromatina dependientes de ATP. El cambio en la estructura del ADN se puede correlacionar con la regulación de la transcripción. Esta es una técnica fácil y altamente sensible que utiliza una cantidad muy pequeña de ADN puro para registrar los cambios estructurales en el oligonucleótido.
Este método puede proporcionar información sobre la regulación de la transcripción mediada por proteínas de remodelación de cromatina dependientes de ATP. Para comenzar, prepare las concentraciones de trabajo de tampones y otros componentes de reacción fresco y manténgalas a cuatro grados Celsius antes de configurar las reacciones, luego mida la actividad atpasa de la proteína en presencia de diferentes moléculas de ADN utilizando un ensayo de oxidación acoplado a NADH. Mezcle ADAAD 0.1 milimolares, ATP milimolar, 10 ADN nanomolar y 1X REG buffer en una placa de 96 pocillos a un volumen final de 250 microlitros.
A continuación, incube la reacción durante 30 minutos en una incubadora de 37 grados Celsius, luego mida la cantidad de NAD + utilizando el software proporcionado junto con el lector de microplacas. Para medir la absorbancia a 340 nanómetros, haga clic en el ensayo NADH y coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa en el instrumento, luego haga clic en el botón de lectura de la placa para registrar la absorbancia. Recoge los espectros del CD en cubetas de cuarzo de alta transparencia.
Use cubetas rectangulares o cilíndricas. Para limpiar las cubetas, lávelas con agua varias veces, luego tome un escaneo del agua o tampón en la cubeta para verificar si está limpia. Para las reacciones, use oligonucleótidos de ADN purificados con PAGE.
Para un enfriamiento rápido, caliente el ADN a 94 grados Celsius durante tres minutos en el bloque de calentamiento e inmediatamente enfríelo en hielo. Para un enfriamiento lento, después de calentar el ADN a 94 grados Celsius durante tres minutos, deje que se enfríe a temperatura ambiente a una velocidad de un grado Celsius por minuto. Para registrar los espectros de referencia, configure un total de cinco reacciones de control una por una en tubos centrífugos de 1,5 mililitros.
Mantenga el volumen de reacción en 300 microlitros en todas las reacciones. Para registrar los espectros del CD, configure un total de cinco reacciones experimentales una por una en tubos centrífugos de 1,5 mililitros. Para grabar el escaneo, encienda el gas y encienda el espectrómetro de CD.
Después de 10 a 15 minutos, encienda la lámpara, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura del soporte a 37 grados centígrados. A continuación, abra el software de espectro de CD y configure la temperatura a 37 grados Celsius, el rango de longitud de onda de 180 a 300 nanómetros, el tiempo por punto a 0.5 segundos y el número de escaneo a cinco, luego haga clic en el visor de datos profesional, cree un nuevo archivo y cámbiele el nombre con los detalles del experimento y la fecha. A continuación, mezcle las reacciones de referencia y experimentales mediante pipeteo y transfiera cuidadosamente las mezclas de reacción una por una a la cubeta, asegurándose de que no haya burbujas de aire.
Si realiza un experimento de curso de tiempo, incube las reacciones a 37 grados Celsius durante el tiempo requerido, luego realice el escaneo. Agregue EDTA al tampón que contiene el ADN, ATP, magnesio y proteína para detener la hidrólisis de ATP. Para inhibir completamente la actividad de la ATPasa, aumente la concentración de EDTA y el tiempo de incubación.
Reste las líneas de base de las reacciones correspondientes en el software y suavice los datos en el software de espectro de CD o en el software de trazado de datos, luego trace un gráfico de longitud de onda contra la elipticidad media de residuos y analice los picos. Los pliegues M mostraron que ambas hebras del ADN MYC podrían formar una estructura similar a un bucle en el tallo. Las estructuras del pliegue M de la secuencia de ADN hacia adelante y la secuencia de ADN inversa que contiene el G quadruplex GECE se muestran aquí.
Los espectros de CD de GECE enfriado rápidamente en ausencia y presencia de ATP y ADAAD mostraron que ADAAD induce dos picos positivos, uno a 258 nanómetros y el otro a 210 nanómetros. La adición de EDTA deroga este cambio conformacional. Los espectros de CD ahora tienen un pico negativo de 210 nanómetros y una amplia banda positiva con picos de 230 y 250 nanómetros.
El mapeador QGRS y el análisis del pliegue M mostraron que las regiones promotoras de DROSHA, DGCR8 y DICER poseen el potencial de formar estructuras cuadrúplex G y similares al tallo. Los espectros de CD del par cinco de DROSHA mostraron que ADAAD induce un pico negativo a 210 nanómetros y un pico positivo a 260 nanómetros. Este espectro es una característica de ADNA.
Los espectros de CD del par uno de DGCR8 mostraron un pico positivo a 210 nanómetros y un amplio pico negativo a 260 nanómetros. Este espectro es característico de la transición de B a X. Para el par siete dgcr8, se observaron fuertes picos positivos a 210 y 270 nanómetros y un pico negativo a 250 nanómetros.
Este espectro es característico de las estructuras paralelas de ADN cuadrúplex G. Por último, para el par DICER uno, se observó un pico positivo a 210 nanómetros y dos picos negativos, uno a 230 nanómetros y el otro a 260 nanómetros. Estos picos son característicos de una transición de ADN de A a X.
Asegúrese de que la pureza del ADN y la proteína sea del 99% o más. La cubeta debe estar limpia y la línea de base debe ser inferior a un milímetro. Todos los reactivos deben ser puros para que el fondo sea inferior a un milímetro.
