Il protocollo ci permette di visualizzare i cambiamenti nella seconda ristrutturazione del DNA indotti dalle proteine rimodellanti della cromatina ATP-dipendenti. Il cambiamento nella struttura del DNA può essere correlato alla regolazione della trascrizione. Questa è una tecnica facile e altamente sensibile che utilizza una quantità molto piccola di DNA puro per registrare i cambiamenti strutturali nell'oligonucleotide.
Questo metodo può fornire informazioni sulla regolazione della trascrizione mediata dalle proteine di rimodellamento della cromatina dipendenti dall'ATP. Per iniziare, preparare le concentrazioni di lavoro dei tamponi e di altri componenti di reazione freschi e mantenerli a quattro gradi Celsius prima di impostare le reazioni, quindi misurare l'attività ATPasi della proteina in presenza di diverse molecole di DNA utilizzando un test di ossidazione accoppiato NADH. Mescolare ADAAD 0,1 millimolari, ATP due millimolari, DNA nanomolare 10 e tampone REG 1X in una piastra da 96 pozzetti per un volume finale di 250 microlitri.
Quindi, incubare la reazione per 30 minuti in un incubatore a 37 gradi Celsius, quindi misurare la quantità di NAD + utilizzando il software fornito insieme al lettore di micropiastre. Per misurare l'assorbanza a 340 nanometri, fare clic sul test NADH e posizionare la piastra a 96 pozzetti sul supporto della piastra nello strumento, quindi fare clic sul pulsante della piastra di lettura per registrare l'assorbanza. Raccogli gli spettri CD in cuvette di quarzo ad alta trasparenza.
Utilizzare cuvette rettangolari o cilindriche. Per pulire le cuvette, lavarle con acqua più volte, quindi eseguire una scansione dell'acqua o tamponare nella cuvetta per verificare se è pulita. Per le reazioni, utilizzare oligonucleotidi di DNA purificati da PAGE.
Per un raffreddamento rapido, riscaldare il DNA a 94 gradi Celsius per tre minuti sul blocco riscaldante e raffreddarlo immediatamente sul ghiaccio. Per un raffreddamento lento, dopo aver riscaldato il DNA a 94 gradi Celsius per tre minuti, lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente ad una velocità di un grado Celsius al minuto. Per registrare gli spettri basali, impostare un totale di cinque reazioni di controllo una per una in tubi centrifughi da 1,5 millilitri.
Mantenere il volume di reazione a 300 microlitri in tutte le reazioni. Per registrare gli spettri cd, impostare un totale di cinque reazioni sperimentali una per una in tubi centrifughi da 1,5 millilitri. Per registrare la scansione, accendere il gas e accendere lo spettrometro CD.
Dopo 10-15 minuti, accendere la lampada, accendere il bagno d'acqua e impostare la temperatura del supporto a 37 gradi Celsius. Quindi, apri il software dello spettro CD e imposta la temperatura a 37 gradi Celsius, l'intervallo di lunghezze d'onda da 180 a 300 nanometri, il tempo per punto a 0,5 secondi e il numero di scansione a cinque, quindi fai clic sul visualizzatore di dati pro, crea un nuovo file e rinominalo con i dettagli dell'esperimento e la data. Quindi, mescolare la linea di base e le reazioni sperimentali mediante pipettaggio e trasferire con cura le miscele di reazione una per una alla cuvetta, assicurandosi che non ci siano bolle d'aria.
Se si esegue un esperimento di corso temporale, incubare le reazioni a 37 gradi Celsius per il tempo richiesto, quindi eseguire la scansione. Aggiungere EDTA al tampone contenente DNA, ATP, magnesio e proteine per fermare l'idrolisi dell'ATP. Per inibire completamente l'attività dell'ATPasi, aumentare la concentrazione di EDTA e il tempo di incubazione.
Sottrarre le linee di base dalle reazioni corrispondenti nel software e levigare i dati nel software dello spettro CD o nel software di tracciamento dei dati, quindi tracciare un grafico di lunghezza d'onda contro l'ellitticità media dei residui e analizzare i picchi. Le pieghe M hanno mostrato che entrambi i filamenti del DNA MYC potrebbero formare una struttura simile a un anello dello stelo. Le strutture M-fold della sequenza di DNA anteriore e inversa contenente il G quadruplex GECE sono mostrate qui.
Gli spettri CD di GECE raffreddato velocemente in assenza e presenza di ATP e ADAAD hanno dimostrato che ADAAD induce due picchi positivi, uno a 258 nanometri e l'altro a 210 nanometri. L'aggiunta dell'EDTA abroga questo cambiamento conformazionale. Gli spettri CD hanno ora un picco negativo di 210 nanometri e un'ampia banda positiva con picchi a 230 e 250 nanometri.
L'analisi del mappatore QGRS e dell'M-fold ha mostrato che le regioni promotori di DROSHA, DGCR8 e DICER possiedono il potenziale per formare strutture G quadruplex e stem-like. Gli spettri CD della coppia DROSHA cinque hanno mostrato che ADAAD induce un picco negativo a 210 nanometri e un picco positivo a 260 nanometri. Questo spettro è una caratteristica dell'ADNA.
Gli spettri CD della coppia DGCR8 uno hanno mostrato un picco positivo a 210 nanometri e un ampio picco negativo a 260 nanometri. Questo spettro è caratteristico della transizione da B a X. Per la coppia DGCR8 sette, sono stati osservati forti picchi positivi a 210 e 270 nanometri e un picco negativo a 250 nanometri.
Questo spettro è caratteristico delle strutture parallele G quadruplex DNA. Infine, per la coppia DICER uno, sono stati osservati un picco positivo a 210 nanometri e due picchi negativi, uno a 230 nanometri e l'altro a 260 nanometri. Questi picchi sono caratteristici di una transizione del DNA da A a X.
Assicurarsi che la purezza del DNA e delle proteine sia pari o superiore al 99%. La cuvetta deve essere pulita e la linea di base deve essere inferiore a un millidegree. Tutti i reagenti devono essere puri in modo che lo sfondo sia inferiore a un millidegree.
