Le protocole nous permet de visualiser les changements dans la deuxième restructuration de l’ADN induits par les protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP. Le changement dans la structure de l’ADN peut être corrélé à la régulation de la transcription. Il s’agit d’une technique facile et très sensible qui utilise une très petite quantité d’ADN pur pour enregistrer les changements structurels dans l’oligonucléotide.
Cette méthode peut fournir un aperçu de la régulation de la transcription médiée par les protéines de remodelage de la chromatine dépendantes de l’ATP. Pour commencer, préparez les concentrations de travail des tampons et autres composants de réaction fraîchement et maintenez-les à quatre degrés Celsius avant de mettre en place les réactions, puis mesurez l’activité ATPase de la protéine en présence de différentes molécules d’ADN à l’aide d’un test d’oxydation couplé au NADH. Mélanger 0,1 millimolaire ADAAD, deux millimolaires ATP, 10 nanomolaires ADN et 1X tampon REG dans une plaque de 96 puits pour un volume final de 250 microlitres.
Ensuite, incubez la réaction pendant 30 minutes dans un incubateur à 37 degrés Celsius, puis mesurez la quantité de NAD + à l’aide du logiciel fourni avec le lecteur de microplaques. Pour mesurer l’absorbance à 340 nanomètres, cliquez sur le test NADH et placez la plaque de 96 puits sur le support de plaque dans l’instrument, puis cliquez sur le bouton de la plaque de lecture pour enregistrer l’absorbance. Collectez les spectres de CD dans des cuvettes de quartz à haute transparence.
Utilisez des cuvettes rectangulaires ou cylindriques. Pour nettoyer les cuvettes, lavez-les à l’eau plusieurs fois, puis faites un scan de l’eau ou du tampon dans la cuvette pour vérifier si elle est propre. Pour les réactions, utilisez des oligonucléotides d’ADN purifiés page.
Pour un refroidissement rapide, chauffez l’ADN à 94 degrés Celsius pendant trois minutes sur le bloc chauffant et refroidissez-le immédiatement sur de la glace. Pour un refroidissement lent, après avoir chauffé l’ADN à 94 degrés Celsius pendant trois minutes, laissez-le refroidir à la température ambiante à un taux d’un degré Celsius par minute. Pour enregistrer les spectres de base, mettez en place un total de cinq réactions de contrôle une par une dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre.
Maintenir le volume de réaction à 300 microlitres dans toutes les réactions. Pour enregistrer les spectres CD, mettez en place un total de cinq réactions expérimentales une par une dans des tubes centrifuges de 1,5 millilitre. Pour enregistrer le scan, allumez le gaz et allumez le spectromètre CD.
Après 10 à 15 minutes, allumez la lampe, allumez le bain-marie et réglez la température du support à 37 degrés Celsius. Ensuite, ouvrez le logiciel de spectre CD et réglez la température à 37 degrés Celsius, la plage de longueurs d’onde de 180 à 300 nanomètres, le temps par point à 0,5 seconde et le nombre de numérisation à cinq, puis cliquez sur la visionneuse de données pro, créez un nouveau fichier et renommez-le avec les détails de l’expérience et la date. Ensuite, mélangez les réactions de base et expérimentales par pipetage et transférez soigneusement les mélanges réactionnels un par un à la cuvette, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de bulles d’air.
Si vous effectuez une expérience de cours temporel, incubez les réactions à 37 degrés Celsius pendant le temps requis, puis prenez le scan. Ajoutez de l’EDTA au tampon contenant l’ADN, l’ATP, le magnésium et les protéines pour arrêter l’hydrolyse de l’ATP. Pour inhiber complètement l’activité de l’ATPase, augmentez la concentration d’EDTA et le temps d’incubation.
Soustrayez les lignes de base des réactions correspondantes dans le logiciel et lissez les données soit dans le logiciel de spectre CD, soit dans le logiciel de traçage de données, puis tracez un graphique de longueur d’onde par rapport à l’ellipticité moyenne des résidus et analysez les pics. Les plis M ont montré que les deux brins de l’ADN MYC pouvaient former une structure en forme de boucle de tige. Les structures du pli M de la séquence d’ADN avant et arrière contenant le G quadruplex GECE sont montrées ici.
Les spectres CD du GECE à refroidissement rapide en l’absence et en présence d’ATP et d’ADAAD ont montré que l’ADAAD induit deux pics positifs, l’un à 258 nanomètres et l’autre à 210 nanomètres. L’ajout d’EDTA abroge ce changement conformationnel. Les spectres CD ont maintenant un pic négatif de 210 nanomètres et une large bande positive avec des pics à 230 et 250 nanomètres.
L’analyse du mappeur QGRS et du M-fold a montré que les régions promotrices de DROSHA, DGCR8 et DICER possèdent le potentiel de former des structures G quadruplex et de type tige. Les spectres CD de la paire DROSHA cinq ont montré que l’ADAAD induit un pic négatif à 210 nanomètres et un pic positif à 260 nanomètres. Ce spectre est une caractéristique de l’ADNA.
Les spectres CD de la première paire DGCR8 ont montré un pic positif à 210 nanomètres et un large pic négatif à 260 nanomètres. Ce spectre est caractéristique de la transition B vers X. Pour la paire DGCR8 sept, de forts pics positifs à 210 et 270 nanomètres et un pic négatif à 250 nanomètres ont été observés.
Ce spectre est caractéristique des structures parallèles de l’ADN G quadruplex. Enfin, pour la paire DICER un, un pic positif à 210 nanomètres et deux pics négatifs, l’un à 230 nanomètres et l’autre à 260 nanomètres ont été observés. Ces pics sont caractéristiques d’une transition de l’ADN de A à X.
Assurez-vous que la pureté de l’ADN et des protéines est de 99% ou plus. La cuvette doit être propre et la ligne de base doit être inférieure à un millidegree. Tous les réactifs doivent être purs de sorte que l’arrière-plan soit inférieur à un millidegree.
