このプロトコルにより、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質によって誘導されるDNAの再構成の変化を可視化することができます。DNA構造の変化は、転写調節と相関させることができる。これは、少量の純粋なDNAを使用してオリゴヌクレオチドの構造変化を記録する、簡単で高感度な技術です。
この方法は、ATP依存クロマチンリモデリングタンパク質によって媒介される転写調節に関する洞察を提供することができる。まず、バッファーおよび他の反応成分の働く濃度を新たに調製し、反応を設定する前に摂氏4度に保ち、NADH結合酸化アッセイを用いて異なるDNA分子の存在下でタンパク質のATPase活性を測定する。0.1ミリモルADAAD、2ミリモルATP、10ナノモルDNA、1X REGバッファーを96ウェルプレートに250マイクロリットルの最終体積に混合します。
次に、37°Cインキュベーターで30分間反応をインキュベートし、次にマイクロプレートリーダーと一緒に提供されるソフトウェアを使用してNAD+の量を測定する。340ナノメートルで吸光度を測定するには、NADHアッセイをクリックし、機器のプレートホルダーに96ウェルプレートを置き、読み取りプレートボタンをクリックして吸光度を記録します。高透明性のクオーツキュベットでCDスペクトルを収集します。
長方形または円筒状のキュベットを使用します。キュベットをきれいにするには、水で数回洗浄してから、キュベット内の水またはバッファーのスキャンを行い、清潔かどうかを確認します。反応に対しては、PAGE精製DNAオリゴヌクレオチドを使用する。
速い冷却のために、熱ブロックで3分間摂氏94度でDNAを加熱し、すぐに氷の上で冷却します。ゆっくり冷却する場合は、DNAを摂氏94度で3分間加熱した後、1分間に1度の速度で室温まで冷却します。ベースラインスペクトルを記録するには、1.5ミリリットル遠心管に1つずつ5つの制御反応を設定します。
すべての反応で300マイクロリットルで反応量を保ちます。CDスペクトルを記録するために、1.5ミリリットル遠心管に1つずつ5つの実験反応を設定する。スキャンを記録するには、ガスの電源を入れ、CD分光器のスイッチを入れます。
10~15分後、ランプのスイッチを入れ、水浴のスイッチを入れ、ホルダーの温度を摂氏37度に設定します。次に、CDスペクトルソフトウェアを開き、温度を摂氏37度、波長範囲を180~300ナノメートル、ポイント当たりの時間を0.5秒、スキャン数を5に設定し、プロデータビューアをクリックして新しいファイルを作成し、実験の詳細と日付に変更します。次に、ピペット処理によりベースライン反応と実験反応を混合し、反応ミックスを1つずつキュベットに慎重に移し、気泡がないことを確認します。
タイムコース実験を行う場合は、必要な時間に摂氏37度で反応をインキュベートし、スキャンを行います。DNA、ATP、マグネシウム、およびタンパク質を含むバッファーにEDTAを加え、ATP加水分解を停止します。ATPase活性を完全に阻害するには、EDTA濃度およびインキュベーション時間を増加させる。
ソフトウェアの対応する反応からベースラインを引き、CDスペクトルソフトウェアまたはデータプロットソフトウェアのいずれかでデータを平滑化し、平均残基楕円度に対して波長のグラフをプロットし、ピークを分析します。M折り畳みは、MYC DNAの両方の鎖が茎ループ状の構造を形成できることを示した。G四重体GECEを含む前進および逆DNA配列のM折り構造をここに示す。
ATPとADAADの不在時に急速に冷却されたGECEのCDスペクトルは、ADAADが258ナノメートルで1つと210ナノメートルで他の2つの正のピークを誘発することを示した。EDTAの追加は、この立体構造変化を和らげる。CDスペクトルは現在、負の210ナノメートルのピークと230と250ナノメートルでピークを持つ広い正のバンドを持っています。
QGRSマッパーおよびM折り解析は、DROSHA、DGCR8およびDICERのプロモーター領域が、G四重体およびステム様構造を形成する可能性を有することを示した。DROSHAペア5のCDスペクトルは、ADAADが210ナノメートルで負のピークを誘導し、260ナノメートルで正のピークを誘発することを示した。このスペクトルはADNAの特徴です。
DGCR8ペア1のCDスペクトルは、210ナノメートルで正のピークを示し、260ナノメートルで広い負のピークを示した。このスペクトルはBからXへの遷移の特徴である。DGCR8ペア7では、210ナノメートルと270ナノメートルで強い正のピークと250ナノメートルでの負のピークが見られました。
このスペクトルは、並列G四重体DNA構造の特徴である。最後に、DICERペア1では、210ナノメートルで正のピークと2つの負のピーク、1つは230ナノメートル、もう1つは260ナノメートルで観察された。これらのピークは、AからXへのDNA転移の特徴である。
DNAとタンパク質の純度が99%以上であることを確認してください。キュベットは清潔で、ベースラインは1ミリ程度未満でなければなりません。すべての試薬は、背景が1ミリ度未満になるように純粋でなければなりません。
