Membran füzyonu birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Bu protokol, füzyon gözenek açıklığını ve verici salınım dinamiklerini tespit etmek ve üç füzyon modunu ayırt etmek için bir yöntem açıklar; füzyonu kapat, füzyonda kal ve füzyonu küçült. Konfokal mikroskop ve yama-kelepçe kaydının kombinasyonu, füzyon gözeneklerinin açılması ve kapatılmasının görselleştirilmesini ve kinetiklerinin belirlenmesini kolaylaştırır.
Kromafin hücreleri için tanımlanmış olmasına rağmen, burada açıklanan yöntemin prensibi, kromafin hücrelerinin çok ötesinde birçok salgı hücresine yaygın olarak uygulanabilir. Bu yöntemin başarılı bir şekilde uygulanması, sağlıklı primer kromafin hücre kültürü üretme, yeterli plazmid transfeksiyon etkinliği ve yüksek elektrofizyolojik kayıt başarı oranı gibi birkaç genel adıma bağlıdır. Yüzeyde kesik veya kanama olmadan üç sağlam bez seçin ve yağ dokusunu makasla çıkarın.
Bezleri, kan çıkmayana kadar Locke'un çözeltisi ile perfüzyonla yıkayın. Sindirim için, bez şişmeye başlayana kadar 0.22 mikrometrelik bir filtreyle tutturulmuş 30 milimetrelik bir şırınga kullanarak enzim çözeltisini adrenal damardan enjekte edin. Sonra bezleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede bırakın.
Tekrar enjekte edin ve bezleri 10 dakika daha 37 santigrat derecede bırakın. Sindirimden sonra, bezi açmak için bezi adrenal damardan diğer uca uzunlamasına makasla kesin. Beyaz medullayı, parçalar halinde Locke'un çözeltisini içeren 10 santimetrelik bir Petri kabına cımbızlayarak izole edin.
Medullayı makasla kesin ve doğrayın. Medulla süspansiyonunu 80 ila 100 mikrometre naylon ağ ile bir beher içine filtreleyin. Filtrazı 50 mililitrelik bir konik tüpe aktarın ve üç yavaşlama ile üç dakika boyunca 48 x g oda sıcaklığında santrifüj yapın.
Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve pipetle hücre peletini Locke çözeltisi ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 80 ila 100 mikrometrelik bir süzgeçle filtreleyin ve 48 x g oda sıcaklığında üç dakika boyunca yavaşlama ile üç dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 30 mililitre kültür ortamı ile yeniden askıya alın.
Bir hemositometre sayma odası kullanarak hücre sayısını belirleyin. 2.800.000 hücreyi 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 48 x g'de santrifüjleme ile iki dakika boyunca üç yavaşlama ile pelet edin.
Hücre peletine üretici tarafından sağlanan 100 mikrolitre transeksiyon tamponu ekleyin. Ve sonra iki mikrogram PH-mNG plazmid ekleyin. Çözeltiyi yukarı ve aşağı borulayarak süspansiyonu yavaşça karıştırın ve karışımı gecikmeden bir elektroporasyon küvetine aktarın.
Küveti hemen elektroporatöre aktarın, ekran listesinden 005 programını seçin ve elektroporasyon yapmak için Enter tuşuna basın. Elektroporasyondan sonra, küvete hemen 1,8 mililitre orta ekleyin ve steril bir uçla donatılmış bir mikropipetle hafifçe karıştırın. Elektroporasyonlu hücrelerin süspansiyonunun 300 mikrolitresini, bir elektroporasyon reaksiyonu için toplamda beş ila altı tabak kaplayan her bir tabaktaki kapak kaymasına ekleyin.
Bulaşıkları 30 dakika boyunca% 9 karbondioksit ile 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir inkübatöre dikkatlice aktarın ve 30 dakika sonra her yemeğe hafifçe iki mililitre önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Borosilikat cam kılcal damarlardan yama pipetleri bir pipet çektirme makinesi ile çekerek, uçlarını sıvı balmumu ile kaplayarak ve bir mikroforge ile parlatarak hazırlayın. Yama kelepçesi kayıt amplifikatörünü açın ve yazılımı başlatın.
Yazılımın uygun kalsiyum akımını ve kapasitans kayıt parametrelerini ayarlayın. Stimülasyonun 10 saniyede başladığı toplam 60 saniyelik bir kayıt protokolü ayarlayın. Voltaj kelepçesi kaydı için tutma potansiyelini 80 milivolta ayarlayın.
Kalsiyum akışını ve kapasitans sıçramasını indüklemek için uyaran olarak eksi 80 milivolttan 10 milivolta bir saniyelik depolarizasyon ayarlayın. Konfokal mikroskop sistemini açın ve yazılımdaki uygun parametreleri ayarlayın. 458 nanometre, 514 nanometre ve 633 nanometre dahil olmak üzere lazerleri açın ve her floresan probuna göre her lazer için emisyon toplama aralığını ayarlayın.
İyi hücre durumuna ve doğru ifadeye sahip bir çanak seçin ve çanaktaki ortama iki mikrolitre floresan sahte nörotransmitter FFN511 ekleyin. Çanağı 20 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. FFN511'i yükledikten sonra, kayıt odasını hazırlayın ve 50 mikrolitre banyo çözeltisine iki mikrolitre floresan boya A655 ekleyin.
Kapak kaymasını çanaktan cımbızla kayıt odasına aktarın ve hemen A655 içeren banyo solüsyonunu ekleyin. 100X yağ daldırma hedefine bir damla yağ yerleştirin. Odayı mikroskopa monte edin ve yağı sadece kapak kaymasının altına temas ettirmek için ayar düğmesini kullanın.
Hücreleri odaklayın ve mNG ekspresyonuna sahip uygun bir hücre bulmak için parlak alan ve konfokal görüntüleme kullanın. Seçilen hücreyi yakınlaştırın ve boş bölgeleri en aza indirerek görüş alanında ortalayın. XY düzlemi konfokal görüntüleme parametrelerini, FFN511, PH-mNG ve A665'in sabit bir Z-düzleminde, en aza indirilmiş bir zaman aralığıyla ayarlayın.
İnce ayar düğmesiyle odağı hücrenin altına ayarlayın. En iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek ve önemli floresan ağartmayı önlemek için bir ayar bulmak üzere yazılımdaki uyarma lazer gücünü ayarlayın. Bir yama pipetine dokuz mikrolitre dahili çözelti ekleyin ve pipeti yama kelepçeli amplifikatör aşamasının tutucusuna takın.
Bir şırınga ile az miktarda pozitif basınç uygulayın ve banyo çözeltisine bir mikromanipülatörle dokunmak için pipet ucunu hareket ettirin. Amplifikatörün, voltaj darbe testi ile pipet direncinin yaklaşık iki ila dört megaohm arasında olduğunu gösterdiğinden emin olun. Sıvı bağlantısını iptal etmek için LJ/Auto düğmesine basın.
Pipetleri bir mikromanipülatör ile seçilen hücreye doğru hareket ettirin. Hücreye bağlı bir mod oluşturmak için, pipet ucunu hareket ettirerek hücreye dokunun. Bir şırınga ile hafif negatif basınç uygularken tutma potansiyelini sıfırdan eksi 80 milivolta değiştirin.
Direnç bir gigaohm'u geçtikten sonra, konfigürasyonun stabilize olması için yaklaşık 30 saniye bekleyin. Hızlı kapasitansı telafi etmek için C-fast/Auto tuşlarına basın. Bir toptan satış modu oluşturmak için, membran yırtılana kadar şırınga ile kısa ama güçlü negatif basınç darbeleri uygulayın.
Yavaş kapasitansı telafi etmek için C-yavaş/Otomatik tuşlarına basın. Görüntüleme odağını hücre tabanına odaklanacak şekilde hafifçe ayarlayın. İki farklı yazılım uygulamasıyla Başlat düğmelerine tıklayarak konfokal hızlandırılmış görüntüleme ve yama kelepçesi kaydını aynı anda başlatın.
Kayıttan sonra, verilerin kaydedildiğinden emin olun. Tutma potansiyelini sıfır milivolta geri döndürün. Pipetleri banyo solüsyonundan çıkarın ve atın.
Ham görüntüleme dosyalarını herhangi bir üreticiyle veya sağlanan yazılımla açın. İşlem'e gidin, ProcessTools'a tıklayın ve her zaman atlamalı görüntü için yuvarlanan ortalama dosyalar oluşturmak için araçları kullanın. Bu dosyaları kaydedin.
Nicelik altında, Araçlar'a gidin ve stimülasyondan önceki ve sonraki zaman noktalarını kontrol etmek ve her kanaldaki floresan değişikliklerini tanımlamak için Yığın Profili düğmelerine tıklayın. Füzyon etkinlikleri için ilgi çekici bölgeleri daire içine almak üzere Elips çiz düğmesine tıklayın. Resme sağ tıklayın ve kaydetmek için YG'leri Kaydet'e tıklayın.
Ham dosyayı bulmak için Projeleri aç'ı tıklatın. Floresan yoğunluklarını ölçmek üzere ROI dosyasını ham görüntüleme dosyasına yüklemek için resme sağ tıklayın ve YG'leri Yükle'ye tıklayın. Araçlar'a gidin ve yazılımdaki YG'leri Sırala'ya tıklayın ve her YG'nin üç kanalının da izlerini çizin.
Her YG için dijital veriler ve görüntüleme izlemeleri de dahil olmak üzere yatırım getirisi verilerini bir dosya klasörüne kaydetmek için Rapor'u tıklatın. Tüm hücre yama-kelepçe kaydı ve 80 ila 10 milivolt arasında bir saniyelik depolarizasyonun uygulanması ekzos ve endositozu uyandırmak için yapıldı. Uygulanan depolarizasyon, içe doğru bir kalsiyum akımına, ekzositozu gösteren bir kapasitans sıçramasına ve sıçramadan sonra endositozu gösteren bir kapasitans bozunumuna neden oldu.
Hücre tabanında hızlandırılmış görüntüleme ile, bir saniyelik depolarizasyon protokolünün neden olduğu füzyon olayları, FFN511 salınımını yansıtan FFN azalması olarak, FPH ve A655 spot floresan artışı eşliğinde, plazma zarından ve banyo çözeltisinden kaynaştırıcı veziküle PH-mNG ve A655 difüzyonunu yansıtan FFN azalması olarak belirtildi. Şekil, F655 karartma olarak tanımlanan yakın füzyonu sunarken, FPH gecikmeyle devam etti veya bozundu. Şekil, hem PH-mNG hem de A655 lekelerinin varlığı ile tespit edilen kalma füzyonunu temsil etmektedir.
Şekil, PH-mNG noktasının ve A655 noktasının paralel boyut azalmasıyla birlikte paralel FPH ve F655 bozunumu olarak tespit edilen büzülme füzyonunu temsil eder Başarılı kayıt, tüm hücre konfigürasyonunun yama kelepçesi ile oluşturulmasını ve hücre tabanında her kanal için uygun floresan yoğunluğu ile görüntülenmesini gerektirir. Burada açıklanan elektrofizyoloji ve süper çözünürlüklü mikroskopinin kombinasyonu, füzyon gözenek dinamiklerini ve nörodevreleri ölçmek için değerli bir araçtır.
