Bu protokoller, araştırmacıların mitokondriyal oksijen tüketimini ölçmenin ötesine geçmelerine izin verir ve bunun yerine anahtar mitokondriyal son ürünlerin, ATP'nin ve reaktif oksijen türlerinin ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacının oksijen tüketim oranını doğrudan son ürün üretim oranıyla karşılaştırarak mitokondriyal verimliliği ölçebilmesidir. Son ürünün ATP mi yoksa reaktif oksijen mi olduğu.
Teknikler, özellikle kabarcıklardan kaçınmak için ayrıntılara çok dikkat etmeyi gerektirir. İster solunum odasında ister titrasyon şırıngalarında olsunlar, kabarcıklar düşmanınızdır çünkü ölçümleri daha az hassas hale getirirler. İskelet kası biyopsileri alındıktan sonra.
Respirometre odalarını magnezyumsuz ortamlarla doldurun ve inkübasyon odasını kapatın. At iskelet kasının bazal sıcaklığını temsil etmek için alet inkübasyon sıcaklığını 38 santigrat dereceye ayarlayın. Solunum ortamının karıştırılmasını, respirometre odasının dibinde dönen manyetik bir karıştırma kullanarak 750 rpm'ye ayarlayın.
Ardından, floresan sensörlerle etkileşimi önlemek için oda aydınlatmasını kapatın. Oksijen elektroduna 800 milivoltluk bir polarizasyon voltajı ile enerji verin ve elde edilen sinyali bir kazanç ayarı ile yükseltin. Oksijen konsantrasyonunu her iki saniyede bir kaydedin ve oksijen akışını, ilerleyen 40 saniye boyunca oksijen ölçümünün negatif eğimi olarak hesaplayın.
Ardından, ortamın oda havasıyla dengelenmesine izin vererek oksijen sensörünü kalibre edin. Referans oksijen kısmi basıncını, yüksek çözünürlüklü respirometre ve standart atmosferik oksijen konsantrasyonu ile ölçülen barometrik basınca göre hesaplayın. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için yeşil floresan sensörleri kullanın.
Sensörlere 400 ila 500 milivoltta enerji verin ve elde edilen sinyal 1 ila 1.000 kazançla güçlendirilir. Daha sonra, mitokondri eklemeden önce solunum odasına TMRM ekleyin ve mitokondri ilavesinden önce eklenen florofor miktarına karşı floresan sinyalinin basit iki noktalı kalibrasyonunu kullanarak floresan sinyalini kalibre edin. Respirometri titrasyon protokolünün tamamlanmasından sonra, mitokondriyal membran potansiyelinin tamamen çöktüğünü gösteren TMRM floresan sinyalinde daha fazla artış gözlenmeyene kadar birkaç ayırma maddesi titrasyonu vererek TMRM sinyalinin son kalibrasyonunu gerçekleştirin.
Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için mavi floresan sensörleri kullanın ve sensörün doğrusal aralığında beklenen sinyali yakalamak için bu sensörlere ayrı ayrı cihazlar için enerji verin. Magnezyum yeşiline bağlanmak için magnezyum iyonlarıyla rekabet edebilecek katyonları şelatlamak için solunum odasına sekiz mikrolitre iki milimolar EDTA ekleyin. Ardından, solunum odasına dört mikrolitre bir milimolar magnezyum yeşili ekleyin.
Ham floresan sinyalini 100 milimolar magnezyum klorürün 10 x 2 mikrolitre sıralı titrasyonlarıyla kalibre ederek flüoresan sinyalini stabilize etmek için titrasyonlar arasında bir dakika bekleyin. Protokol boyunca ATP konsantrasyonunun zaman içindeki eğimi olan ATTP sentez hızını belirleyin. Solunum odasından gelen floresan sinyalini ölçmek için yeşil floresan sensörleri kullanın.
Sensörlere 300 ila 400 milivoltta enerji verin. Ve ortaya çıkan sinyal, 1 ila 1.000'lik bir kazançla güçlendirilir. Sensörün lineer aralığında beklenen sinyali yakalamak için her bir cihaz için özel ayarları optimize edin.
Mitokondri eklemeden önce, Amplex UltraRed Testinin kimyasal kurulumunu ve ilk kalibrasyonunu gerçekleştirin. Reaksiyona müdahale edebilecek katyonları şelatlamak için 30 mikromol DTPA ekleyin. Daha sonra respirometri odasına süperoksit dismutaz veya serratus peroksidaz ve Amplex UltraRed ekleyin.
Floresan sinyalinin dengelenmesine izin verin. Ardından, beş dakikalık bir boşlukla iki kez 0.2 mikromol hidrojen peroksit ekleyin. Respirometrinin kimyası tahlil boyunca değiştikçe, araştırmacının takdirine bağlı olarak bu kalibrasyon noktalarının spesifik zamanlaması ile tahlil boyunca tahlilin tepkisinin ayarlanmasına izin vermek için tahlil boyunca ek iki noktalı kalibrasyonlar gerçekleştirin.
Düzgün bir numune süspansiyonunu korumak için numuneyi vorteks edin ve her iki mililitrelik inkübasyon odasına 15 mikrolitre izole mitokondri süspansiyonu ekleyin, böylece sonuçlar 18.75 miligram kasın mitokondriyal verimini temsil eder. Herhangi bir substrat eklemeden önce, artık oksijen tüketimini ölçün ve tamamlandıktan sonra substrat unkuplajlı inhibitör titrasyonundaki veya SUIT protokolündeki her adımın oksijen tüketim değerlerinden bu değeri çıkarın. At iskelet kası mitokondriyal fonksiyonunun ilk karakterizasyonuna izin veren genel amaçlı bir SUIT kullanın.
Nikotinamid adenin dinükleotid üretmek ve karmaşık tek bazlı sızıntı yoluyla oksitlenen NADH tarafından desteklenen fosforilasyon olmayan solunumu uyarmak için her bir odaya piruvat, glutamat ve malatın birbirini izleyen ardışık titrasyonları ile başlayın. Daha sonra, karmaşık bir fosforilasyon solunumu yoluyla fosforilasyon solunumunu uyarmak için ADP ekleyin. Kompleks bir ve karmaşık iki fosforilleyici solunumu birleştirerek fosforilasyon solunumu üretmek için süksinat ekleyin Karmaşık olanı bloke etmek için rotenon ekleyin.
Ortaya çıkan oksijen akışı, kompleks ikinin, tek başına süksinatın oksidasyonu ile mitokondriyal oksijen tüketimini destekleme kapasitesini temsil eder. At iskelet kası mitokondriyal solunumu ve göreceli membran potansiyelinin yüksek çözünürlüklü respirometri izi gösterilmiştir. TMRM ile inkübe edilen mitokondrinin solunum değerleri, floroforun inhibitör etkisi nedeniyle daha düşüktür.
Mitokondriyal solunum ve ATTP sentezi yüksek oranda mitokondri içeren at iskelet kasının zengin tip bir iskelet kası lifi içeren ve istirahat metabolizmasına yaklaşan koşullar altında inkübe edildiği gösterilmiştir. At iskelet kası mitokondriyal solunumu ve hidrojen peroksit üretiminin respirometri izi gösterilmiştir. Yüksek çözünürlüklü respirometri çok sabır gerektirir.
Tahlili yürüten kişi, kararlı bir duruma ulaşılıp ulaşılmadığı ve bir sonraki adımın gerçekleşebileceği konusunda bir yargı çağrısı yapması gereken çok sayıda zaman noktasına sahip olacaktır. Yalnızca tek bir titrasyon protokolü gösterdik. Mitokondriyal metabolizma ile ilgili belirli soruları ele almak için aynı şekilde uygulanabilecek düzinelerce daha protokol vardır.
