Genleşme mikroskobunun en önemli sınırlamalarından biri, polimerizasyon ve sindirimden sonra floresan yavaşlamasıdır. LR-ExM dediğimiz etiket tutma genleşme mikroskobu, polimerizasyon ve sindirim için üç fonksiyonlu ankrajlar kullanır. Tri fonksiyonlu ankrajı kullandıktan sonra, genleşme adımından sonra floresan kullanıyoruz.
Bu nedenle, yüksek çözünürlüğe sahipken iyi sinyal-gürültü oranını koruyoruz. Etiket tutma genleşme mikroskobu, daha önce tanıtılan diğer genişleme mikroskopileri ve ayrıca floresan mikroskopileri ile birleştirilebilir. Çok yönlü yöntemde çok sağlamdır.
Ve yüksek regülasyonlu görüntüleme için, gelişmiş bir sinyale sahip olmak gerçekten önemlidir. Başlamak için, 37 santigrat derecede tam ortama ve% 5 karbondioksite sahip 16 iyi çıkarılabilir odacıklı bir kapak camı üzerindeki kültür hücreleri. Hücre sayıları yaklaşık 40.000'e ulaştığında, PEM tamponunda 100 mikrolitre% 3.2 PFA içeren hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika sabitleyin.
Daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 100 mikrolitre permeablizasyon tamponu ile 15 dakika boyunca geçirgenleştirin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş streptavidin çözeltisi ile hücreleri inkübe edin ve ardından 200 mikrolitre hücre bloke edici tampon ile kısa bir süre durulayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir hücre bloke edici tamponda seyreltilmiş 100 mikrolitre biyotin çözeltisi ile inkübe edin.
Daha sonra, sıçan anti alfa tübülin antikoru ve tavşan anti klatrin ağır zincir antikoru içeren 100 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ile hücreleri, dört santigrat derecede 16 saat veya oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Daha sonra hücreleri üç fonksiyonel çapa, eşek anti tavşan kazma MA ve eşek anti sıçan biyotin MA içeren 100 mikrolitre ikincil antikor çözeltisi ile oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin. Proteinleri hidrojel üzerine sabitlemek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 100 mikrolitre% 0.25 Glutaraldehit ile hücreleri inkübe edin.
16 kuyucuklu plakanın üst yapısını tıraş bıçağı veya tercih ettiğiniz herhangi bir çıkarma aleti ile çıkarın ve alt kapak camını saklayın. Kapak camını bir Petri kabına yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Hücreleri koşullandırmak için her bir kuyucuğa 45 mikrolitre bir monomer çözeltisi ekleyin.
Beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Jelasyon çözeltisini yapmak için 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpü hazırlayın. Monomer, çift damıtılmış su ve% 10T med karıştırın.
Sülfat başına amonyum henüz eklemeyin. Bu arada, jelasyon çözeltisi tüpünü buzun üzerinde tutun. Jelasyon çözeltisine% 10 amonyum persülfat ekleyin.
Hemen 40 mikrolitre jelasyon çözeltisini buz üzerinde bir jelasyon çözeltisi saklarken her bir kuyucuğun üzerine pipet yerleştirin. Kuyu plakasını üç dakika daha buzun üzerine yerleştirin. 37 santigrat derece inkübasyon sırasında jelin nemini korumak için, Petri kabını kapakla kaplayın ve Petri kabına birkaç damla su koyun.
Numuneyi ışıktan korurken, kapak camını ve 10 santimetrelik Petri kabını, jelasyon için 1,5 saat boyunca 37 santigrat derecelik bir inkübatöre taşıyın. Jelleşmeden sonra, her jeli ayırmak için kapak camını kesin. Jelleri altı kuyucuk plakasına aktarın.
Her bir oyuğa iki mililitre sindirim tamponu ekleyin. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında veya dört saat boyunca 37 santigrat derecede bırakın. Daha sonra, jelleri son jel hacminden en az 10 kat fazla su hacmiyle yıkayın, yıkama adımını her seferinde 20 ila 30 dakika boyunca dört kez tekrarlayın ve jel her boyutta yaklaşık dört kat genişler.
Numuneleri karanlıkta tutarken jelleri oda sıcaklığında 24 saat boyunca iki ila beş mikromolar streptavidin boya ve / veya anti digoxigenin boya ile iki mililitre hacimli streptavidin digoxigenin boyama tamponunda inkübe edin. Daha sonra jeli aşırı suyla iki ila dört kez yıkayın ve genişletin. Her yıkama yaklaşık 30 dakika ila bir saat sürer.
Floresan mikroskopi altında hücrelerin daha kolay görselleştirilmesi için, üçüncü yıkama sırasında hücreleri DAPI ile lekeleyin. DAPI stoğunu yıkama suyunda bir ila 5.000 sanrıda seyreltin. Jeli bir DAPI çözeltisi ile 30 dakika ila bir saat boyunca inkübe edin.
Daha sonra üç mililitre su ile iki kez daha yıkayın. Jel numunelerini hareketsiz hale getirmek için altı kuyucuklu cam taban görüntüleme odasını üç mililitre% 0.01 polilizin ile kaplayın. Daha sonra jel numunelerini kodlanmış görüntüleme odasına aktarın ve numuneleri istenen floresan kapsamlarıyla görüntüleyin.
Etiket tutma genleşme mikroskobu, protein tutma genleşme mikroskobu veya biyotin genleşme mikroskobu örneklerine kıyasla gelişmiş floresan etiketleme gösterir. Etiket tutma genleşme mikroskobu, protein tutma genleşme mikroskobuna kıyasla yaklaşık altı kat daha yüksek floresan sinyali gösterir. LR-ExM, alt kırılma sınırı çözünürlüğüne sahip klatrin kaplı çukurlar gibi küçük yapıları etkili bir şekilde yakalayabilir.
Mikrotübüller ve klatrin kaplı çukurlar, fonksiyonel ankrajlar, NHS MA dig ve NHS MA biyotin kullanılarak ko-immün boyalardı. Benzer şekilde, klatrin kaplı çukurlar ve mitokondri, BG MA biyotin ve BC MA kazma gibi üç fonksiyonel ankrajlı enzimatik bir protein etiketi yaklaşımı kullanılarak etiketlendi. Ayrıca, immün boyama temelli yaklaşım ve enzimatik protein etiketi yaklaşımı, lamin klima ve nükleopore kompleksinin yapısını göstermek için birleştirilmiştir.
Etiket tutma genişleme mikroskobu, fare beyin dokusunda, presinaptik belirteç, Fagot ve postsinaptik belirteç, Homer 1'i boyayan ko-immün boya ile gerçekleştirildi. İki etiket net ve iyi ayrılmıştı, bu da yüksek çözünürlüğü ve etiketleme verimliliğini destekliyordu. Emek tutma genleşme mikroskobu, daha önce tanıtılan diğer genleşme mikroskopileriyle birleştirilebilen çok yönlü ve sağlam bir yöntemdir.
Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için, moleküler ölçek yapısını daha iyi yakalamak için iyi bir etiketleme verimliliği elde etmek önemlidir. İşgücü tutma genleşme mikroskobu, sinyali geliştirmek için etkili ve sağlam bir yöntemdir.
