Sarkopeni ve nöromüsküler hastalıkların ayırt edici bir özelliği olan kas içi yağın incelenmesinde önemli bir engel, özellikle dondurulmuş doku kesitlerinde adipositlerin etkili bir şekilde korunması ve daha sonra görselleştirilmesidir. Protokol, kas içi yağın sağlam, titiz ve tekrarlanabilir görselleştirmesi ve nicelleştirilmesi için hizalanmış adiposit morfolojisini ve iskelet kası bölümlerini korur. Analiz boru hattımız, Duchenne kas distrofisi gibi hastalıklarda yağ oluşumunu önlemek için yeni müdahaleleri doğrulamak için bir çerçeve sağlar Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir araştırma teknisyeni olan Connor Johnson olacaktır.
Başlamak için, dezenfekte etmek için taze bir alkollü mendille enjekte edilecek bacağı temizleyin. İnsülin şırıngasına 30 ila 50 mikrolitre% 50 gliserol çekin. TA'nın yerini ortaya çıkarmak için saçları hafifçe fırçalayın. TA'yı bulduktan sonra, iğneyi ayak bileğinin yakınında distal olarak TA'ya yerleştirin.
İğneyi kasın içine tamamen yerleştirin ve yavaşça gliserol enjekte edin, aynı zamanda kasın çoğuna zarar vermeye yardımcı olan iğneyi yavaş yavaş geri çekin. Saçları diseksiyon alanından ve aletlerden uzak tutmaya yardımcı olmak için farenin kesilecek herhangi bir alanına% 70 etanol ile serbestçe püskürtün. Pelvisin yakınındaki bacağın üst kısmındaki cildi kesmek için makas kullanın.
Bacağın derisini yukarıdan aşağıya doğru ayak bileğine doğru yavaşça çekin. İlk olarak, TA'yı toplamadan önce keskin uçlu cımbız kullanarak dış bağ dokusu tabakasını çıkarın. TA'nın altındaki cımbızları kasın altından distal tendondan başlayarak kaydırın ve yavaşça dize doğru yukarı doğru çekin. Kasın sonunda durun.
Alt dizde hissedilen direnci geçmeyin. Alt diz seviyesine ulaşmadan önce önemli bir direnç varsa, artık bağ dokusu katmanlarını çıkarmaya devam edin ve durun. TA, cımbızla bacağından kısmen kaldırıldıktan sonra, TA'nın alt dize bağlantısını kesmek için aynı hareketi bir neşterle kullanın.
TA'yı tamamen çıkarmak için ayak bileğindeki tendonu makasla bağırsaklayın. Liflere zarar vermemek için sadece tendondaki kası tutun. TA'nın üçte birini sonunda, tendonun karşısında kesin. Mikro santrifüj tüpüne koyun ve sıvı azot içine düşürerek dondurun.
Dokunun diğer üçte ikisini, histoloji için% 4 PFA ile etiketlenmiş bir kuyuya batırın. İlk ve son dokunun fiksatif olarak ne zaman yerleştirildiğini takip ettiğinizden emin olun. Dört santigrat derecede iki ila iki buçuk saat boyunca bir nutatöre yerleştirin.
Fiksasyondan sonra, PFA'yı kuyucuklardan çıkarın. Dokuları soğuk bir X PBS ile iki ila üç kez durulayın ve daha sonra yıkama başına beş dakika boyunca soğuk 1X PBS ile iki ila üç kez yıkayın. PBS'yi kuyucuklardan çıkarın ve dokunun yüzmesine izin vermek için 1X PBS'ye yeteri kadar% 30 sakkaroz ekleyin.
Nutator'a gece boyunca dört santigrat derecede yerleştirin. Mikroskobu açın ve görüntüleme yazılımını başlatın. Slaytı sahne alanında sabitleyin.
Görüntülenecek alanı tanımlamak için herhangi bir kanalı kullanın. Görüntüleme yazılımında, her kanal için kazanç ve pozlama süresini ayarlayın. Her kanaldaki tüm dokunun görüntülerini alın ve tam TA kesitinin bir bileşimini oluşturmak için tek tek karoları birleştirin.
Başlamadan önce, RNase içermeyen suyu 45 santigrat dereceye ısıtın ve taze% 70 etanol hazırlayın. Numuneyi içeren her tüpe 1000 mikrolitre guanidinyum tiyosiyanat ekleyin. Boncuk Çırpıcı onaylı tüplerin kullanılması önemlidir.
Her tüpe üç orta boy boncuk veya bir büyük ve bir küçük boncuk ekleyin. Bir Boncuk Çırpıcı kullanarak dokuyu iki ila dört dakika boyunca 50 Hertz'de homojenize edin. Doku tipine ve numune büyüklüğüne bağlı olarak, 10 dakika kadar sürebilir.
200 mikrolitre kloroform ekleyin. Örnekleri 15 saniye boyunca sallayın. Oda sıcaklığında iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın.
12.000 kez G.Pipet'te 15 dakika boyunca santrifüj yapın ve 350 mikrolitre% 70 etanol içeren yeni bir mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Alt protein ve / veya DNA katmanlarını aspire etmemeye dikkat edin. Bu karışımın 700 mikrolitresine kadar, iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir mini sıkma kolonuna aktarın.
Üreticinin talimatlarını izleyerek RNA izolasyonu ile devam edin. Beklenen verime bağlı olarak 30 ila 50 mikrolitre RNaz içermeyen su ile sültü. RNA'yı buz üzerinde tutun ve bir spektrofotometre kullanarak verimi ölçün.
RNA'yı eksi 80 santigrat derecede saklayın. Üreticinin talimatlarını izleyerek cDNA'yı bir cDNA sentez kiti ile sentezlemek için bir mikrogram RNA kullanın. Çalıştırma tamamlandıktan sonra, 80 mikrolitre RNase içermeyen su ekleyin.
Örnekleri eksi 20 santigrat derecede saklayın. 384 kuyucuk formatı kullanarak, her bir kuyucuğun dibine bir mikrolitre astar ekleyin. Serbest kurutma primerleri daha sıkı teknik kopyalar sağlar.
Astarlar tamamen buharlaşana kadar kapalı bırakın. Dört ila sekiz teknik çoğaltma ile numune reaksiyonları ayarlayın. PCR çalışması tamamlandıktan sonra, ham döngü eşik değerlerini temizlik gen seviyelerine normalleştirin ve delta-delta Ct.Perilipin ve sabitlenmemiş TA'lardan pozitif adipositleri hesaplayarak kıvrım değişikliklerini belirleyin, sabit bölümlere kıyasla morfolojiyi önemli ölçüde değiştirdi, bu da tanımlamalarını, görselleştirmelerini ve sonraki bir nicelemeyi çok daha zor ve potansiyel olarak yanlış hale getirdi.
Buna karşılık, PFA fiksasyonu adiposit morfolojisini koruyarak kas içi yağın doğru bir şekilde tespit edilmesini sağlar. Yaralanmamış TA kası ile karşılaştırıldığında, gliserol hasarı, yaralanmadan sonraki üç gün içinde PPAR gama ve CEBP alfa gibi erken adipojenik belirteçlerin ekspresyonunu indükler. Adiponektin ve perilipin gibi olgun belirteçler, gliserol hasarından beş gün sonra tespit edilebilir.
Genetik soy izlemeyi kullanarak, PDGF reseptörü alfa FAP'larının çoğunluğu soy belirteci EYFP'yi eksprese eder. Gliserol hasarından yedi gün sonra, EYFP pozitif FAP'lar, adipositleri eksprese eden EYFP pozitif perilipine dönüşmüş ve FAP'ların gerçekten kas içi yağın hücresel kökeni olduğunu göstermiştir. Protokol ayrıca miyojenik bölmeyi görselleştirmek için uyarlanabilir.
PAX7 ve MYOD1'e karşı antikorlar kullanılarak, sırasıyla kasların kök hücre ve miyoblast belirteçleri, PFA sabit kas dokusu bölümlerinde bile, gliserol hasarından beş gün sonra kolayca tespit edilebilir. Bu protokol ayrıca adipositleri ve diğer yetişkin dokuları görselleştirmek ve ölçmek için uyarlanabilir. Ayrıca doku koruma tekniğimiz farklı ayakta durma tekniklerinin çeşitliliği ile uyumludur.
