サルコペニアおよび神経筋疾患の特徴である筋肉内脂肪を研究する上で重要な障壁の1つは、特に凍結組織切片における脂肪細胞の効果的な保存およびその後の可視化である。このプロトコルは、脂肪細胞の形態と骨格筋セクションを保持し、筋肉内脂肪の堅牢で厳密で再現性のある視覚化と定量化を実現します。私たちの分析パイプラインは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの疾患における脂肪形成を防ぐための新しい介入を検証するためのフレームワークを提供します 手順を実証するのは、私の研究室の研究技術者であるコナージョンソンです。
まず、消毒するために新鮮なアルコールワイプで注射する脚をきれいにします。30〜50マイクロリットルの50%グリセロールをインスリンシリンジに引き込む。すねの毛をそっとブラッシングして、TAの位置を露出させます。TAの位置を特定したら、足首付近の遠位でTAに針を挿入します。
筋肉に完全に針を挿入し、ゆっくりとグリセロールを注入しながら、筋肉の大部分を傷つけるのに役立つ針を徐々に引き抜きます。切除するマウスの任意の領域に70%エタノールを自由にスプレーして、髪を解剖領域や器具から遠ざけます。はさみを使って骨盤の近くの脚の上部の皮膚を切ってください。
脚の皮膚を上から足首まで優しく引っ張ります。まず、TAを採取する前に鋭利な先端ピンセットを用いて外側結合組織層を除去する。遠位腱から始めて、筋肉の下からTAの下にあるピンセットをスライドさせ、膝に向かってゆっくりと上に引っ張ります。筋肉の端で止まる。
下膝で感じた抵抗を押しのけないでください。下膝に達する前に大きな抵抗がある場合は、停止して結合組織の残りの層を除去し続けます。ピンセットでTAを脚から部分的に持ち上げたら、メスで同じ動きをして、TAと下膝の接続を切断します。
足首の腱をはさみで腸に入れ、TAを完全に取り除きます。繊維を傷つけないように、腱の筋肉だけを扱います。最後にTAの3分の1を切断し、腱の反対側に切る。それをマイクロ遠沈管に入れ、液体窒素に滴下してスナップフリーズします。
組織の残りの3分の2を組織学のために4%PFAで標識されたウェルに沈める。最初と最後の組織が固定液に入れられた時期を必ず追跡してください。摂氏4度で2〜2時間半栄養剤の上に置きます。
固定後、PFAをウェルから除去する。冷たい1つのX PBSで組織を2〜3回すすぎ、冷たい1X PBSで2〜3回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。PBSをウェルから取り出し、組織が浮遊できるように1X PBSに十分な30%スクロースを加える。
一晩4°Cでヌーテーターの上に置きます。顕微鏡の電源を入れ、イメージングソフトウェアを起動します。スライドをステージに固定します。
任意のチャンネルを使用して、画像化する領域を識別します。イメージングソフトウェアで、各チャンネルのゲインと露光時間を調整します。各チャンネルの組織全体の画像を撮影し、個々のタイルをマージして、完全なTA断面の合成を作成します。
開始する前に、RNaseフリーウォーターを摂氏45度に予熱し、新鮮な70%エタノールを準備します。1000マイクロリットルのチオシアン酸グアニジニウムを試料を含む各チューブに加える。ビーズビーター承認のチューブが使用されていることが重要です。
3つのミディアムビーズ、または1つの大きなビーズと1つの小さなビーズを各チューブに追加します。ビーズビーターを使用して、組織を50ヘルツで2〜4分間均質化します。組織の種類とサンプルサイズによっては、最大10分かかる場合があります。
200マイクロリットルのクロロホルムを加える。サンプルを15秒間振る。室温で2〜3分間インキュベートする。
350マイクロリットルの透明な上清をG.Pipetteで12,000回G.ピペットで15分間遠心分離し、350マイクロリットルの70%エタノールを含む新しいマイクロ遠心管に加える。下のタンパク質および/またはDNA層を吸引しないように注意してください。この混合物の最大700マイクロリットルを、2ミリリットルの収集管に入れたミニスピンカラムに移す。
製造元の指示に従って RNA 単離を続行します。期待される収量に応じて、30〜50マイクロリットルのRNase自由水で溶出する。RNAを氷上に保ち、分光光度計を使用して収率を測定します。
RNAはマイナス80°Cに保管してください。メーカーの指示に従って、cDNA合成キットでcDNAを合成するには、最大1マイクログラムのRNAを使用してください。実行が完了したら、80マイクロリットルのRNase自由水を加えます。
サンプルをマイナス 20 °C で保管します。384ウェルフォーマットを使用して、各ウェルの底に1マイクロリットルのプライマーを加える。遊離乾燥プライマーは、よりタイトな技術的複製をもたらす。
プライマーが完全に蒸発するまで覆ったままにしておきます。4 ~ 8 回のテクニカル反復でサンプル反応を設定します。PCRの実行が完了したら、生サイクルの閾値をハウスキーピング遺伝子レベルに正規化し、デルタデルタCt.ペリリピンを計算することによってフォールドの変化を決定し、固定されていないTAからの陽性脂肪細胞は固定切片と比較して形態を有意に変化させ、それらの同定、可視化、およびその後の定量化をはるかに困難かつ潜在的に不正確にする。
対照的に、PFA固定は脂肪細胞の形態を維持し、筋肉内脂肪の正確な検出を可能にする。損傷を受けていないTA筋肉と比較して、グリセロール損傷は、損傷後3日以内の早期にPPARガンマおよびCEBPアルファなどの早期脂肪生成マーカーの発現を誘導する。アディポネクチンやペリリピンなどの成熟マーカーは、グリセロール損傷の5日後にも検出できます。
遺伝子系統追跡を用いて、PDGF受容体アルファFAPの大部分は、系統マーカーEYFPを発現する。グリセロール損傷から7日後、EYFP陽性FAPは脂肪細胞を発現するEYFP陽性ペリリピンに変わり、FAPが実際に筋肉内脂肪の細胞起源であることを実証した。このプロトコルはまた、筋原性コンパートメントを視覚化するように適合させることができる。
PAX7およびMYOD1に対する抗体を用いて、筋肉幹細胞および筋芽細胞マーカーは、それぞれ、PFA固定筋肉組織切片においても、グリセロール損傷の5日後に容易に検出することができる。このプロトコルはまた、脂肪細胞および他の成体組織を視覚化および定量化するために適合させることができる。さらに、当社の組織保存技術は、さまざまなスタンディング技術と互換性があります。
