Une barrière importante dans l’étude de la graisse intramusculaire, une caractéristique de la sarcopénie et des maladies neuromusculaires, est la préservation efficace et la visualisation ultérieure des adipocytes, en particulier dans les sections de tissus congelés. Le protocole préserve la morphologie des adipocytes et les sections musculaires squelettiques alignées pour une visualisation et une quantification robustes, rigoureuses et reproductibles de la graisse intramusculaire. Notre pipeline d’analyse fournit un cadre pour valider de nouvelles interventions visant à prévenir la formation de graisse dans des maladies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne La démonstration de la procédure sera assurée par Connor Johnson, un technicien de recherche de mon laboratoire.
Pour commencer, nettoyez la jambe à injecter avec une lingette d’alcool frais pour désinfecter. Aspirer 30 à 50 microlitres de glycérol à 50% dans la seringue à insuline. Brossez doucement les cheveux sur le tibia pour exposer l’emplacement de l’AT. Après avoir localisé l’AT, insérez l’aiguille dans l’AT distalement près de la cheville.
Insérez complètement l’aiguille dans le muscle et injectez lentement du glycérol, tout en retirant progressivement l’aiguille, ce qui aide à blesser la majeure partie du muscle. Vaporisez généreusement toutes les zones de la souris à couper avec de l’éthanol à 70% pour aider à empêcher les cheveux de disséquer la zone et les instruments. Utilisez des ciseaux pour couper la peau autour du haut de la jambe près du bassin.
Tirez doucement la peau de la jambe du haut vers le bas jusqu’à la cheville. Tout d’abord, retirez la couche externe de tissu conjonctif à l’aide d’une pince à épiler à pointe pointue avant de prélever l’AT. Faites glisser la pince à épiler sous le TA du bas du muscle, en commençant par le tendon distal et tirez doucement vers le haut vers le genou. Arrêtez-vous à la fin du muscle.
Ne poussez pas au-delà de la résistance ressentie au niveau du genou inférieur. S’il y a une résistance importante avant d’atteindre le genou inférieur, arrêtez et continuez à enlever les couches restantes de tissu conjonctif. Une fois que l’AT a été partiellement soulevée de la jambe avec la pince à épiler, utilisez le même mouvement avec un scalpel pour couper la connexion de l’AT au genou inférieur.
Videz le tendon à la cheville avec des ciseaux pour enlever complètement le TA. Ne manipulez le muscle qu’au niveau du tendon pour éviter d’endommager les fibres. Coupez un tiers de l’AT à la fin, en face du tendon. Mettez-le dans le tube de microcentrifugation et congelez-le en le laissant tomber dans de l’azote liquide.
Immergez les deux autres tiers du tissu dans un puits marqué avec 4% de PFA pour l’histologie. Assurez-vous de garder une trace du moment où le premier et le dernier tissu ont été placés en fixateur. Placer sur un nutateur pendant deux à deux heures et demie à quatre degrés Celsius.
Après la fixation, retirez le PFA des puits. Rincez les mouchoirs avec un PBS X froid deux à trois fois, puis lavez deux à trois fois avec du PBS 1X froid pendant cinq minutes par lavage. Retirez le PBS des puits et ajoutez suffisamment de saccharose à 30% dans 1X PBS pour permettre au tissu de flotter.
Placer sur le nutator à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Allumez le microscope et lancez le logiciel d’imagerie. Fixez la diapositive sur la scène.
Utilisez n’importe quel canal pour identifier la zone à imager. Dans le logiciel d’imagerie, ajustez le gain et le temps d’exposition pour chaque canal. Prenez des images de l’ensemble du tissu dans chaque canal et fusionnez des carreaux individuels pour former un composite de la section transversale TA complète.
Avant de commencer, préchauffez l’eau sans RNase à 45 degrés Celsius et préparez de l’éthanol frais à 70%. Ajouter 1000 microlitres de thiocyanate de guanidinium à chaque tube contenant l’échantillon. Il est important que des tubes approuvés par Bead Beater soient utilisés.
Ajoutez trois perles moyennes, ou une grande et une petite perle, à chaque tube. Homogénéiser le tissu à 50 Hertz pendant deux à quatre minutes à l’aide d’un batteur de perles. Selon le type de tissu et la taille de l’échantillon, cela peut prendre jusqu’à 10 minutes.
ajouter 200 microlitres de chloroforme. Secouez les échantillons pendant 15 secondes. Incuber pendant deux à trois minutes à température ambiante.
Centrifuger pendant 15 minutes à 12 000 fois G.Pipette 350 microlitres du surnageant clair et ajouter à un nouveau tube de microcentrifugation contenant 350 microlitres d’éthanol à 70%. Veillez à ne pas aspirer les couches inférieures de protéines et/ou d’ADN. Transférez jusqu’à 700 microlitres de ce mélange dans une mini colonne de spin placée dans un tube de collecte de deux millilitres.
Poursuivez avec l’isolement de l’ARN en suivant les instructions du fabricant. Elute avec 30 à 50 microlitres d’eau sans RNase, selon le rendement attendu. Gardez l’ARN sur la glace et mesurez le rendement à l’aide d’un spectrophotomètre.
Gardez l’ARN stocké à moins 80 degrés Celsius. Utilisez jusqu’à un microgramme d’ARN pour synthétiser l’ADNc avec un kit de synthèse d’ADNc, en suivant les instructions du fabricant. Une fois la course terminée, ajoutez 80 microlitres d’eau libre de RNase.
Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. À l’aide d’un format de puits 384, ajoutez un microlitre d’apprêt au fond de chaque puits. Les apprêts de séchage gratuits permettent d’obtenir des répliques techniques plus serrées.
Laisser couvert jusqu’à ce que les amorces se soient complètement évaporées. Mettre en place des réactions d’échantillon avec quatre à huit répétitions techniques. Une fois l’exécution de la PCR terminée, normalisez les valeurs seuils du cycle brut aux niveaux de gènes d’entretien ménager et déterminez les changements de plis en calculant le delta-delta Ct.La perilipine et les adipocytes positifs des AT non fixés ont considérablement modifié la morphologie par rapport aux sections fixes, ce qui rend leur identification, leur visualisation et une quantification ultérieure beaucoup plus difficiles et potentiellement inexactes.
En revanche, la fixation PFA préserve la morphologie des adipocytes, permettant une détection précise de la graisse intramusculaire. Par rapport au muscle TA non blessé, la lésion au glycérol induit l’expression de marqueurs adipogènes précoces, tels que le PPAR gamma et le CEBP alpha dès trois jours après la blessure. Les marqueurs matures tels que l’adiponectine et la périilline peuvent être détectés dès cinq jours après une lésion au glycérol.
En utilisant le traçage génétique de la lignée, la majorité des FAP alpha du récepteur PDGF expriment le marqueur de lignée EYFP. Sept jours après une lésion au glycérol, les PAF positives à l’EYFP se sont transformées en adipocytes exprimant la périlipine positive à l’EYFP, démontrant que les PAF sont en effet l’origine cellulaire de la graisse intramusculaire. Le protocole peut également être adapté pour visualiser le compartiment myogénique.
L’utilisation d’anticorps contre PAX7 et MYOD1, les marqueurs de cellules souches musculaires et de myoblastes, respectivement, peut être facilement détectée cinq jours après une lésion au glycérol, même dans les sections de tissu musculaire fixe PFA. Ce protocole peut également être adapté pour visualiser et quantifier les adipocytes et autres tissus adultes. De plus, notre technique de préservation des tissus est compatible avec la variété des différentes techniques debout.
