Uma barreira significativa no estudo da gordura intramuscular, marca registrada de sarcopenia e doenças neuromusculares, é a efetiva preservação e posterior visualização de adipócitos, especialmente em seções de tecido congelado. O protocolo preserva a morfologia adipócito e seções musculares esqueléticas alinhadas para visualização robusta, rigorosa e reprodutível e quantificação de gordura intramuscular. Nosso pipeline de análise fornece uma estrutura para validar novas intervenções para prevenir a formação de gordura em doenças como distrofia muscular de Duchenne Demonstrando que o procedimento será Connor Johnson, um técnico de pesquisa do meu laboratório.
Para começar, limpe a perna a ser injetada com um lenço de álcool fresco para desinfetar. Escante-se de 30 a 50 microliters de 50% glicerol na seringa de insulina. Escove suavemente o cabelo na canela para expor a localização do TA. Depois de localizar o TA, insira a agulha no TA distally perto do tornozelo.
Insira totalmente a agulha no músculo e injete lentamente glicerol, enquanto gradualmente retira a agulha que ajuda a ferir a maior parte do músculo. Pulverizar liberalmente todas as áreas do mouse para serem cortadas com 70% de etanol para ajudar a manter o cabelo fora da área de dissecação e instrumentos. Use uma tesoura para cortar a pele ao redor da parte superior da perna perto da pelve.
Puxe suavemente a pele da perna de cima para baixo até o tornozelo. Primeiro, remova a camada externa do tecido conjuntivo usando pinças afiadas antes de colher o TA. Deslize as pinças por baixo do TA a partir da parte inferior do músculo, começando no tendão distal e puxe suavemente para cima em direção ao joelho. Pare no final do músculo.
Não empurre além da resistência sentida no joelho inferior. Se houver uma resistência significativa antes de atingir o joelho inferior, pare e continue removendo as camadas restantes do tecido conjuntivo. Uma vez que o TA tenha sido parcialmente levantado da perna com a pinça, use o mesmo movimento com um bisturi para cortar a conexão do TA com o joelho inferior.
Estripe o tendão do tornozelo com uma tesoura para remover totalmente o TA. Só manuseie o músculo no tendão para evitar danificar as fibras. Corte um terço do TA no final, em frente ao tendão. Coloque-o no tubo de micro centrífuga e estonte-o, deixando-o em nitrogênio líquido.
Submergir os outros dois terços do tecido em um poço rotulado com 4% de PFA para histologia. Certifique-se de acompanhar quando o primeiro e último tecido foi colocado em fixação. Coloque em um nutador por duas a duas horas e meia a quatro graus Celsius.
Após a fixação, remova o PFA dos poços. Enxágüe os tecidos com um X PBS frio duas a três vezes e depois lave duas a três vezes com PBS 1X frio por cinco minutos por lavagem. Retire o PBS dos poços e adicione sacarose suficiente de 30% no PBS 1X para permitir que o tecido flutue.
Coloque no nutador a quatro graus Celsius durante a noite. Ligue o microscópio e inicie o software de imagem. Segure o slide no palco.
Use qualquer canal para identificar a área a ser imagen. No software de imagem, ajuste o tempo de ganho e exposição de cada canal. Pegue imagens de todo o tecido em cada canal e mescle telhas individuais para fazer um composto da seção transversal ta completa.
Antes de começar, pré-aqueça a água livre RNase a 45 graus Celsius e prepare 70% de etanol fresco. Adicione 1000 microliters de tiocianato de guanidinium a cada tubo contendo a amostra. É importante que os tubos aprovados pelo Bead Beater estejam sendo usados.
Adicione três contas médias, ou uma grande e uma pequena, em cada tubo. Homogeneize o tecido a 50 Hertz por dois a quatro minutos usando um Batedor de Contas. Dependendo do tipo de tecido e tamanho da amostra, pode levar até 10 minutos.
adicionar 200 microliters de clorofórmio. Agite as amostras por 15 segundos. Incubar por dois a três minutos em temperatura ambiente.
Centrifugar por 15 minutos a 12.000 vezes G.Pipette fora 350 microliters do supernatante claro e adicionar a um novo tubo de micro centrífugas contendo 350 microliters de 70% de etanol. Tenha cuidado para não aspirar as camadas de proteína e/ou DNA inferiores. Transfira até 700 microliters desta mistura para uma coluna mini spin colocada em um tubo de coleta de dois mililitros.
Continue com o isolamento do RNA seguindo as instruções do fabricante. Elute com 30 a 50 microliters de água livre RNase, dependendo do rendimento esperado. Mantenha o RNA no gelo e meça o rendimento usando um espectrofotômetro.
Mantenha o RNA armazenado a menos 80 graus Celsius. Use até um micrograma de RNA para sintetizar o CDNA com um kit de síntese cDNA, seguindo as instruções do fabricante. Depois que a corrida estiver completa, adicione 80 microliters de água livre RNase.
Armazene as amostras a menos 20 graus Celsius. Usando um formato 384 bem, adicione um microliter de primer na parte inferior de cada poço. Primers de secagem grátis resultam em réplicas técnicas mais apertadas.
Deixe coberto até que os primers tenham evaporado completamente. Configure reações amostrais com quatro a oito réplicas técnicas. Após a execução do PCR ser concluída, normalize os valores do limiar do ciclo bruto para os níveis genéticos de limpeza e determine mudanças de dobra calculando o Delta-Delta Ct.Perilipin e adipócitos positivos dos TAs não fixados têm morfologia significativamente alterada em comparação com seções fixas, tornando sua identificação, visualização e uma quantificação subsequente muito mais difícil e potencialmente imprecisa.
Em contraste, a fixação pfa preserva a morfologia adipócito, permitindo a detecção precisa de gordura intramuscular. Em comparação com o músculo TA não ferido, a lesão do glicerol induz a expressão de marcadores adipogênicos precoces, como ppar gama e ALFA CEBP logo após três dias de lesão. Marcadores maduros como adiponectina e perilipina podem ser detectados até cinco dias após a lesão do glicerol.
Usando rastreamento de linhagem genética, a maioria dos FAPs alfa do receptor PDGF expressam o marcador de linhagem EYFP. Sete dias após lesão de glicerol, as FAPs positivas da EYFP transformaram-se em perilipina positiva da EYFP expressando adipócitos, demonstrando que as FAPs são de fato a origem celular da gordura intramuscular. O protocolo também pode ser adaptado para visualizar o compartimento miogênico.
Usando anticorpos contra PAX7 e MYOD1, os músculos células-tronco e marcadores myoblast, respectivamente podem ser facilmente detectados cinco dias após lesão glicerol, mesmo em seções de tecido muscular fixo PFA. Este protocolo também pode ser adaptado para visualizar e quantificar adipócitos e outros tecidos adultos. Além disso, nossa técnica de preservação de tecidos é compatível com a variedade de diferentes técnicas em pé.
