Eine signifikante Barriere bei der Untersuchung von intramuskulärem Fett, einem Kennzeichen von Sarkopenie und neuromuskulären Erkrankungen, ist die effektive Erhaltung und anschließende Visualisierung von Adipozyten, insbesondere in gefrorenen Gewebeschnitten. Das Protokoll bewahrt die Adipozytenmorphologie und die Skelettmuskelabschnitte, die für eine robuste, rigorose und reproduzierbare Visualisierung und Quantifizierung von intramuskulärem Fett ausgerichtet sind. Unsere Analyse-Pipeline bietet einen Rahmen für die Validierung neuartiger Interventionen zur Verhinderung der Fettbildung bei Krankheiten wie der Duchenne-Muskeldystrophie Das Verfahren wird Connor Johnson, ein Forschungstechniker aus meinem Labor, demonstrieren.
Reinigen Sie zunächst das Bein, das mit einem frischen Alkoholtuch injiziert werden soll, um es zu desinfizieren. Ziehen Sie 30 bis 50 Mikroliter 50% Glycerin in die Insulinspritze. Bürsten Sie vorsichtig die Haare am Schienbein auf, um die Position der TA freizulegen. Nachdem Sie den TA lokalisiert haben, führen Sie die Nadel in die TA in der Nähe des Knöchels ein.
Führen Sie die Nadel vollständig in den Muskel ein und injizieren Sie langsam Glycerin, während Sie die Nadel allmählich zurückziehen, wodurch der größte Teil des Muskels verletzt wird. Besprühen Sie großzügig alle Bereiche der Maus, die geschnitten werden sollen, mit 70% Ethanol, um das Haar von Sezierbereichen und Instrumenten fernzuhalten. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut um die Oberseite des Beines in der Nähe des Beckens zu schneiden.
Ziehen Sie die Haut des Beines sanft von oben bis zum Knöchel. Entfernen Sie zuerst die äußere Bindegewebsschicht mit einer Pinzette mit scharfer Spitze, bevor Sie die TA ernten. Schieben Sie die Pinzette von der Unterseite des Muskels unter die TA, beginnend an der distalen Sehne und ziehen Sie sie vorsichtig nach oben in Richtung Knie. Stoppen Sie am Ende des Muskels.
Drücken Sie nicht an dem Widerstand vorbei, der am unteren Knie zu spüren ist. Wenn es einen signifikanten Widerstand gibt, bevor Sie das untere Knie erreichen, stoppen Sie und entfernen Sie die verbleibenden Bindegewebeschichten. Sobald der TA teilweise mit der Pinzette vom Bein angehoben wurde, verwenden Sie die gleiche Bewegung mit einem Skalpell, um die Verbindung des TA zum unteren Knie zu trennen.
Entkernen Sie die Sehne am Knöchel mit einer Schere, um die TA vollständig zu entfernen. Behandeln Sie nur den Muskel an der Sehne, um eine Beschädigung der Fasern zu vermeiden. Schneiden Sie ein Drittel der TA am Ende, gegenüber der Sehne. Legen Sie es in das Mikrozentrifugenröhrchen und schocken Sie es ein, indem Sie es in flüssigen Stickstoff fallen lassen.
Tauchen Sie die anderen zwei Drittel des Gewebes in einen markierten Brunnen mit 4% PFA für die Histologie. Achten Sie darauf, zu verfolgen, wann das erste und letzte Gewebe in Fixiermittel gegeben wurde. Auf einen Nutator für zwei bis zweieinhalb Stunden bei vier Grad Celsius legen.
Entfernen Sie nach der Fixierung PFA aus den Vertiefungen. Spülen Sie das Gewebe zwei- bis dreimal mit kaltem 1X PBS ab und waschen Sie es dann zwei bis drei Mal mit kaltem 1X PBS für fünf Minuten pro Wäsche. Entfernen Sie das PBS aus den Vertiefungen und fügen Sie genügend 30% Saccharose in 1X PBS hinzu, damit das Gewebe schwimmen kann.
Über Nacht bei vier Grad Celsius auf den Nutator legen. Schalten Sie das Mikroskop ein und starten Sie die Bildgebungssoftware. Sichern Sie die Folie auf der Bühne.
Verwenden Sie einen beliebigen Kanal, um den abzubildenden Bereich zu identifizieren. Passen Sie in der Bildgebungssoftware die Verstärkungs- und Belichtungszeit für jeden Kanal an. Machen Sie Bilder des gesamten Gewebes in jedem Kanal und fügen Sie einzelne Kacheln zusammen, um eine Komposition des gesamten TA-Querschnitts zu erstellen.
Bevor Sie beginnen, heizen Sie RNase-freies Wasser auf 45 Grad Celsius vor und bereiten Sie frisches 70% Ethanol vor. Fügen Sie 1000 Mikroliter Guanidiniumthiocyanat zu jedem Röhrchen hinzu, das die Probe enthält. Es ist wichtig, dass von Bead Beater zugelassene Rohre verwendet werden.
Fügen Sie jeder Tube drei mittlere Perlen oder eine große und eine kleine Perle hinzu. Homogenisieren Sie das Gewebe bei 50 Hertz für zwei bis vier Minuten mit einem Bead Beater. Je nach Gewebetyp und Probengröße kann es bis zu 10 Minuten dauern.
200 Mikroliter Chloroform hinzufügen. Schütteln Sie die Proben 15 Sekunden lang. Bei Raumtemperatur zwei bis drei Minuten inkubieren.
Zentrigieren Sie für 15 Minuten bei 12.000 mal G.Pipette 350 Mikroliter des klaren Überstands und fügen Sie zu einem neuen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das 350 Mikroliter 70% Ethanol enthält. Achten Sie darauf, die unteren Protein- und/oder DNA-Schichten nicht abzusaugen. Übertragen Sie bis zu 700 Mikroliter dieser Mischung auf eine Mini-Spin-Säule, die in einem Zwei-Milliliter-Auffangrohr platziert ist.
Fahren Sie mit der RNA-Isolierung gemäß den Anweisungen des Herstellers fort. Elute mit 30 bis 50 Mikrolitern RNasefreiem Wasser, abhängig von der erwarteten Ausbeute. Halten Sie RNA auf Eis und messen Sie die Ausbeute mit einem Spektralphotometer.
Halten Sie die RNA bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Verwenden Sie bis zu einem Mikrogramm RNA, um cDNA mit einem cDNA-Synthesekit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu synthetisieren. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, fügen Sie 80 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu.
Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius. Verwenden Sie ein 384-Well-Format, fügen Sie einen Mikroliter Primer an der Unterseite jedes Wells hinzu. Freie Trocknungsgrundierungen führen zu engeren technischen Nachbildungen.
Bedeckt lassen, bis die Primer vollständig verdunstet sind. Richten Sie Probenreaktionen mit vier bis acht technischen Replikaten ein. Nachdem der PCR-Lauf abgeschlossen ist, normalisieren Sie die Schwellenwerte des Rohzyklus auf die Genspiegel und bestimmen Sie die Faltenänderungen durch Berechnung von Delta-Delta-Ct.Perilipin und positive Adipozyten aus den unfixierten TAs haben die Morphologie im Vergleich zu festen Abschnitten signifikant verändert, was ihre Identifizierung, Visualisierung und eine nachfolgende Quantifizierung viel schwieriger und potenziell ungenauer macht.
Im Gegensatz dazu bewahrt die PFA-Fixierung die Morphologie der Adipozyten, was einen genauen Nachweis von intramuskulärem Fett ermöglicht. Im Vergleich zu unverletztem TA-Muskel induziert eine Glycerinverletzung die Expression von frühen adipogenen Markern wie PPAR gamma und CEBP alpha bereits drei Tage nach der Verletzung. Reife Marker wie Adiponektin und Perilipin können bereits fünf Tage nach einer Glycerinverletzung nachgewiesen werden.
Unter Verwendung der genetischen Abstammungsverfolgung exprimiert die Mehrheit der PDGF-Rezeptor-alpha-FAPs den Abstammungsmarker EYFP. Sieben Tage nach der Glycerinverletzung haben sich EYFP-positive FAPs in EYFP-positive Perilipin-exprimierende Adipozyten verwandelt, was zeigt, dass FAPs tatsächlich der zelluläre Ursprung von intramuskulärem Fett sind. Das Protokoll kann auch angepasst werden, um das myogene Kompartiment zu visualisieren.
Mit Antikörpern gegen PAX7 und MYOD1 können Muskelstammzell- bzw. Myoblastenmarker fünf Tage nach der Glycerinverletzung leicht nachgewiesen werden, selbst in PFA-fixierten Muskelgewebeabschnitten. Dieses Protokoll kann auch angepasst werden, um Adipozyten und andere erwachsene Gewebe zu visualisieren und zu quantifizieren. Darüber hinaus ist unsere Gewebekonservierungstechnik mit der Vielfalt der verschiedenen Stehtechniken kompatibel.
