أحد الحواجز الهامة في دراسة الدهون العضلية ، وهي السمة المميزة للساركوبينيا والأمراض العصبية العضلية ، هو الحفظ الفعال والتصور اللاحق للخلايا الشحمية ، خاصة في أقسام الأنسجة المجمدة. يحافظ البروتوكول على مورفولوجيا الخلايا الشحمية وأقسام العضلات الهيكلية المحاذاة للتصور القوي والصارم والقابل للتكرار وتحديد كمية الدهون العضلية. يوفر خط أنابيب التحليل الخاص بنا إطارا للتحقق من صحة التدخلات الجديدة لمنع تكوين الدهون في أمراض مثل ضمور دوشين العضلي مما يدل على الإجراء كونور جونسون ، فني أبحاث من مختبري.
للبدء ، قم بتنظيف الساق ليتم حقنها بمنديل كحولي طازج لتطهيره. اسحب ما يصل إلى 30 إلى 50 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 50٪ في حقنة الأنسولين. قم بتنظيف الشعر بلطف على الساق لكشف موقع TA. بعد تحديد موقع TA ، أدخل الإبرة في TA بشكل بعيد بالقرب من الكاحل.
أدخل الإبرة بالكامل في العضلات وحقن الجلسرين ببطء ، مع سحب الإبرة تدريجيا مما يساعد على إصابة معظم العضلات. رش أي مناطق من الماوس بحرية ليتم تقطيعها باستخدام 70٪ من الإيثانول للمساعدة في الحفاظ على الشعر بعيدا عن منطقة وأدوات التشريح. استخدم المقص لقطع الجلد حول الجزء العلوي من الساق بالقرب من الحوض.
اسحب جلد الساق بلطف من الأعلى إلى الكاحل. أولا ، قم بإزالة طبقة النسيج الضام الخارجية باستخدام ملاقط ذات أطراف حادة قبل حصاد TA. حرك الملقط أسفل TA من أسفل العضلات، بدءا من الوتر البعيد واسحب بلطف لأعلى نحو الركبة. توقف عند نهاية العضلات.
لا تتجاوز المقاومة التي شعرت بها في أسفل الركبة. إذا كانت هناك مقاومة كبيرة قبل الوصول إلى أسفل الركبة ، فتوقف واستمر في إزالة الطبقات المتبقية من النسيج الضام. بمجرد رفع TA جزئيا من الساق باستخدام الملقط ، استخدم نفس الحركة مع مشرط لقطع اتصال TA بالركبة السفلية.
أمعاء الوتر في الكاحل بمقص لإزالة TA بالكامل. تعامل فقط مع العضلات الموجودة في الوتر لتجنب إتلاف الألياف. قطع ثلث TA في النهاية ، مقابل الوتر. ضعه في أنبوب جهاز الطرد المركزي الصغير وقم بتجميده عن طريق إسقاطه في النيتروجين السائل.
غمر الثلثين الآخرين من الأنسجة في بئر مصنف مع 4٪ PFA لعلم الأنسجة. تأكد من تتبع متى تم وضع الأنسجة الأولى والأخيرة في المثبت. ضعيه على المغذيات لمدة ساعتين إلى ساعتين ونصف الساعة عند أربع درجات مئوية.
بعد التثبيت ، قم بإزالة PFA من الآبار. شطف الأنسجة مع بارد واحد X PBS مرتين إلى ثلاث مرات ثم غسل مرتين إلى ثلاث مرات مع الباردة 1X PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. قم بإزالة PBS من الآبار وأضف ما يكفي من 30٪ من السكروز في 1X PBS للسماح للأنسجة بالطفو.
ضعيه على المغذي عند أربع درجات مئوية طوال الليل. قم بتشغيل المجهر وقم بتشغيل برنامج التصوير. قم بتأمين الشريحة على المسرح.
استخدم أي قناة لتحديد المنطقة المراد تصويرها. في برنامج التصوير، اضبط وقت الكسب والتعرض لكل قناة. التقط صورا للنسيج بأكمله في كل قناة وادمج البلاط الفردي لإنشاء مركب من المقطع العرضي الكامل ل TA.
قبل البدء ، قم بتسخين الماء الخالي من RNase إلى 45 درجة مئوية وقم بإعداد 70٪ من الإيثانول الطازج. أضف 1000 ميكرولتر من ثيوسيانات جوانيدينيوم إلى كل أنبوب يحتوي على العينة. من المهم أن يتم استخدام الأنابيب المعتمدة من Bead Beater.
أضف ثلاث حبات متوسطة الحجم ، أو حبة كبيرة وخرزة صغيرة واحدة ، إلى كل أنبوب. قم بتجانس الأنسجة عند 50 هرتز لمدة دقيقتين إلى أربع دقائق باستخدام دعامة الخرز. اعتمادا على نوع الأنسجة وحجم العينة، قد يستغرق الأمر ما يصل إلى 10 دقائق.
إضافة 200 ميكرولتر من الكلوروفورم. رج العينات لمدة 15 ثانية. احتضن لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.
جهاز طرد مركزي لمدة 15 دقيقة في 12،000 مرة G.Pipette من 350 ميكرولتر من supernatant واضحة وإضافة إلى أنبوب الطرد المركزي الصغيرة الجديدة التي تحتوي على 350 ميكرولتر من 70 ٪ من الإيثانول. احرص على عدم استنشاق طبقات البروتين و / أو الحمض النووي السفلية. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من هذا الخليط إلى عمود دوران صغير يوضع في أنبوب تجميع بملليلترين.
استمر في عزل الحمض النووي الريبي باتباع تعليمات الشركة المصنعة. Elute مع 30 إلى 50 ميكرولتر من الماء الحر RNase ، اعتمادا على العائد المتوقع. احتفظ بالحمض النووي الريبي على الجليد وقم بقياس العائد باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
حافظ على تخزين الحمض النووي الريبي عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. استخدم ما يصل إلى ميكروغرام واحد من الحمض النووي الريبي لتوليف cDNA مع مجموعة توليف cDNA ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بعد اكتمال التشغيل ، أضف 80 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase.
تخزين العينات في درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. باستخدام تنسيق بئر 384 ، أضف ميكرولتر واحد من التمهيدي إلى أسفل كل بئر. تؤدي الاشعال للتجفيف الحر إلى نسخ متماثلة تقنية أكثر إحكاما.
اتركيه مغطى حتى يتبخر الاشعال تماما. قم بإعداد تفاعلات العينة باستخدام أربعة إلى ثمانية نسخ متماثلة فنية. بعد اكتمال تشغيل PCR ، قم بتطبيع قيم عتبة الدورة الخام إلى مستويات جينات التدبير المنزلي وتحديد تغييرات الأضعاف عن طريق حساب دلتا دلتا دلتا Ct.Perilipin والخلايا الشحمية الإيجابية من TAs غير الثابتة قد غيرت بشكل كبير المورفولوجيا مقارنة بالأقسام الثابتة ، مما يجعل تحديدها وتصورها وتحديدها كميا لاحقا أكثر صعوبة وربما غير دقيقة.
في المقابل ، يحافظ تثبيت PFA على مورفولوجيا الخلايا الشحمية ، مما يسمح بالكشف الدقيق عن الدهون العضلية. بالمقارنة مع عضلة TA غير المصابة ، فإن إصابة الجلسرين تحفز التعبير عن العلامات الشحمية المبكرة ، مثل PPAR gamma و CEBP alpha في أقرب وقت بعد ثلاثة أيام من الإصابة. يمكن الكشف عن العلامات الناضجة مثل أديبونيكتين وبيريليبين في وقت مبكر من خمسة أيام بعد إصابة الجلسرين.
باستخدام تتبع النسب الوراثي ، تعبر غالبية مستقبلات PDGF ألفا FAPs عن علامة النسب EYFP. بعد سبعة أيام من إصابة الجلسرين ، تحولت FAPs الإيجابية EYFP إلى perilipin إيجابي EYFP يعبر عن الخلايا الشحمية ، مما يدل على أن FAPs هي في الواقع الأصل الخلوي للدهون العضلية. يمكن أيضا تكييف البروتوكول لتصور المقصورة العضلية.
باستخدام الأجسام المضادة ضد PAX7 و MYOD1 ، يمكن اكتشاف الخلايا الجذعية للعضلات وعلامات اللاستيدات العضلية ، على التوالي ، بسهولة بعد خمسة أيام من إصابة الجلسرين ، حتى في أقسام الأنسجة العضلية الثابتة PFA. يمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتصور وقياس الخلايا الشحمية والأنسجة البالغة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، تتوافق تقنية الحفاظ على الأنسجة لدينا مع مجموعة متنوعة من التقنيات الدائمة المختلفة.
