Una barrera importante en el estudio de la grasa intramuscular, un sello distintivo de la sarcopenia y las enfermedades neuromusculares, es la preservación efectiva y la posterior visualización de los adipocitos, especialmente en las secciones de tejido congelado. El protocolo preserva la morfología de los adipocitos y las secciones del músculo esquelético alineadas para una visualización y cuantificación robusta, rigurosa y reproducible de la grasa intramuscular. Nuestra línea de análisis proporciona un marco para validar intervenciones novedosas para prevenir la formación de grasa en enfermedades como la distrofia muscular de Duchenne Demostrando el procedimiento estará Connor Johnson, un técnico de investigación de mi laboratorio.
Para comenzar, limpie la pierna para inyectarla con una toallita con alcohol fresco para desinfectar. Extraiga de 30 a 50 microlitros de glicerol al 50% en la jeringa de insulina. Cepille suavemente el cabello en la espinilla para exponer la ubicación de la AT. Después de localizar la AT, inserte la aguja en la TA distalmente cerca del tobillo.
Inserte completamente la aguja en el músculo e inyecte lentamente glicerol, mientras retira gradualmente la aguja, lo que ayuda a lesionar la mayor parte del músculo. Rocíe generosamente cualquier área del ratón que se corte con etanol al 70% para ayudar a mantener el cabello fuera del área de disección y los instrumentos. Use tijeras para cortar la piel alrededor de la parte superior de la pierna cerca de la pelvis.
Tire suavemente de la piel de la pierna desde la parte superior hasta el tobillo. Primero, retire la capa externa de tejido conectivo con pinzas de punta afilada antes de cosechar el TA. Deslice las pinzas debajo de la TA desde la parte inferior del músculo, comenzando en el tendón distal y tire suavemente hacia arriba hacia la rodilla. Deténgase en el extremo del músculo.
No empuje más allá de la resistencia que se siente en la parte inferior de la rodilla. Si hay una resistencia significativa antes de llegar a la parte inferior de la rodilla, deténgase y continúe eliminando las capas sobrantes de tejido conectivo. Una vez que la AT se haya levantado parcialmente de la pierna con las pinzas, use el mismo movimiento con un bisturí para cortar la conexión de la TA con la parte inferior de la rodilla.
Destripe el tendón en el tobillo con tijeras para eliminar completamente la AT. Solo maneje el músculo en el tendón para evitar dañar las fibras. Corte un tercio de la AT en el extremo, frente al tendón. Póngalo en el tubo de la micro centrífuga y congélelo dejándolo caer en nitrógeno líquido.
Sumergir los otros dos tercios del tejido en un pozo marcado con 4% de PFA para histología. Asegúrese de realizar un seguimiento de cuándo se colocó el primer y último tejido en fijador. Coloque en un nutator durante dos a dos horas y media a cuatro grados centígrados.
Después de la fijación, retire el PFA de los pozos. Enjuague los pañuelos con un X PBS frío dos o tres veces y luego lave dos o tres veces con 1X PBS frío durante cinco minutos por lavado. Retire el PBS de los pocillos y agregue suficiente 30% de sacarosa en 1X PBS para permitir que el tejido flote.
Coloque en el nutator a cuatro grados centígrados durante la noche. Encienda el microscopio e inicie el software de imágenes. Asegure la diapositiva en el escenario.
Utilice cualquier canal para identificar el área a la que se va a crear una imagen. En el software de imágenes, ajuste el tiempo de ganancia y exposición para cada canal. Tome imágenes de todo el tejido en cada canal y fusione mosaicos individuales para hacer un compuesto de la sección transversal completa de TA.
Antes de comenzar, precaliente el agua libre de RNasa a 45 grados centígrados y prepare etanol fresco al 70%. Añadir 1000 microlitros de tiocianato de guanidinio a cada tubo que contenga la muestra. Es importante que se utilicen tubos aprobados por Bead Beater.
Agregue tres cuentas medianas, o una grande y una pequeña, a cada tubo. Homogeneice el tejido a 50 Hertz durante dos a cuatro minutos usando un Bead Beater. Dependiendo del tipo de tejido y el tamaño de la muestra, puede tardar hasta 10 minutos.
añadir 200 microlitros de cloroformo. Agite las muestras durante 15 segundos. Incubar durante dos o tres minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar durante 15 minutos a 12.000 veces G.Pipetear 350 microlitros del sobrenadante transparente y añadir a un nuevo tubo de microcentrífuga que contiene 350 microlitros de etanol al 70%. Tenga cuidado de no aspirar las capas inferiores de proteína y/o ADN. Transfiera hasta 700 microlitros de esta mezcla a una mini columna de centrifugado colocada en un tubo de recolección de dos mililitros.
Continúe con el aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. Elute con 30 a 50 microlitros de agua libre de RNasa, dependiendo del rendimiento esperado. Mantenga el ARN en hielo y mida el rendimiento con un espectrofotómetro.
Mantenga el ARN almacenado a menos 80 grados centígrados. Utilice hasta un microgramo de ARN para sintetizar ADNc con un kit de síntesis de ADNc, siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez completada la carrera, agregue 80 microlitros de agua libre de RNasa.
Almacene las muestras a menos 20 grados centígrados. Usando un formato de 384 pozos, agregue un microlitro de imprimación al fondo de cada pozo. Las imprimaciones de secado libre dan como resultado réplicas técnicas más ajustadas.
Dejar tapado hasta que los cebadores se hayan evaporado por completo. Configure reacciones de muestra con cuatro a ocho réplicas técnicas. Una vez completada la ejecución de PCR, normalice los valores umbral del ciclo bruto a los niveles de genes de limpieza y determine los cambios de pliegue mediante el cálculo de delta-delta Ct.La perilipina y los adipocitos positivos de los AATT no fijos han alterado significativamente la morfología en comparación con las secciones fijas, lo que hace que su identificación, visualización y una cuantificación posterior sean mucho más difíciles y potencialmente inexactas.
Por el contrario, la fijación de PFA preserva la morfología de los adipocitos, lo que permite una detección precisa de la grasa intramuscular. En comparación con el músculo TA no lesionado, la lesión por glicerol induce la expresión de marcadores adipogénicos tempranos, como PPAR gamma y CEBP alfa tan pronto como tres días después de la lesión. Los marcadores maduros como la adiponectina y la perilipina se pueden detectar tan pronto como cinco días después de la lesión por glicerol.
Utilizando el rastreo genético del linaje, la mayoría de los FAP alfa del receptor PDGF expresan el marcador de linaje EYFP. Siete días después de la lesión por glicerol, los FAP positivos para EYFP se han convertido en perilipina EYFP positiva que expresa adipocitos, lo que demuestra que los FAP son de hecho el origen celular de la grasa intramuscular. El protocolo también se puede adaptar para visualizar el compartimento miogénico.
Usando anticuerpos contra PAX7 y MYOD1, los marcadores de células madre y mioblastos musculares, respectivamente, se pueden detectar fácilmente cinco días después de la lesión por glicerol, incluso en secciones de tejido muscular fijo de PFA. Este protocolo también se puede adaptar para visualizar y cuantificar adipocitos y otros tejidos adultos. Además, nuestra técnica de preservación de tejidos es compatible con la variedad de diferentes técnicas de pie.
