Una barriera significativa nello studio del grasso intramuscolare, un segno distintivo della sarcopenia e delle malattie neuromuscolari, è l'efficace conservazione e successiva visualizzazione degli adipociti, specialmente nelle sezioni di tessuto congelato. Il protocollo preserva la morfologia degli adipociti e le sezioni muscolari scheletriche allineate per una visualizzazione e una quantificazione robuste, rigorose e riproducibili del grasso intramuscolare. La nostra pipeline di analisi fornisce un quadro per convalidare nuovi interventi per prevenire la formazione di grasso in malattie come la distrofia muscolare di Duchenne A dimostrare la procedura sarà Connor Johnson, un tecnico di ricerca del mio laboratorio.
Per iniziare, pulire la gamba da iniettare con una salvietta alcolica fresca per disinfettare. Aspirare da 30 a 50 microlitri di glicerolo al 50% nella siringa da insulina. Spazzolare delicatamente i capelli sullo stinco per esporre la posizione del TA. Dopo aver localizzato il TA, inserire l'ago nel TA distalmente vicino alla caviglia.
Inserire completamente l'ago nel muscolo e iniettare lentamente glicerolo, mentre gradualmente si ritira l'ago che aiuta a ferire la maggior parte del muscolo. Spruzzare liberamente tutte le aree del mouse da tagliare con etanolo al 70% per aiutare a tenere i capelli lontani dall'area di dissezione e dagli strumenti. Usa le forbici per tagliare la pelle intorno alla parte superiore della gamba vicino al bacino.
Tirare delicatamente la pelle della gamba dall'alto verso il basso fino alla caviglia. In primo luogo, rimuovere lo strato esterno di tessuto connettivo utilizzando una pinzetta a punta affilata prima di raccogliere l'AT. Far scorrere le pinzette sotto l'AT dal fondo del muscolo, iniziando dal tendine distale e tirare delicatamente verso l'alto verso il ginocchio. Fermati alla fine del muscolo.
Non spingere oltre la resistenza avvertita nella parte inferiore del ginocchio. Se c'è una resistenza significativa prima di raggiungere il ginocchio inferiore, fermarsi e continuare a rimuovere gli strati rimanenti di tessuto connettivo. Una volta che il TA è stato parzialmente sollevato dalla gamba con le pinzette, utilizzare lo stesso movimento con un bisturi per interrompere la connessione del TA al ginocchio inferiore.
Budellare il tendine alla caviglia con le forbici per rimuovere completamente il TA. Maneggiare solo il muscolo al tendine per evitare di danneggiare le fibre. Tagliare un terzo del TA alla fine, di fronte al tendine. Mettilo nel tubo della micro centrifuga e congelalo a scatto facendolo cadere in azoto liquido.
Immergere l'altro due terzi del tessuto in un pozzo etichettato con il 4% di PFA per l'istologia. Assicurati di tenere traccia di quando il primo e l'ultimo tessuto sono stati posti in fissativo. Mettere su un nutator per due o due ore e mezza a quattro gradi Celsius.
Dopo la fissazione, rimuovere il PFA dai pozzetti. Risciacquare i fazzoletti con uno X PBS freddo due o tre volte e quindi lavare due o tre volte con 1X PBS freddo per cinque minuti per lavaggio. Rimuovere il PBS dai pozzetti e aggiungere abbastanza 30% di saccarosio in 1X PBS per consentire al tessuto di galleggiare.
Posizionare sul nutator a quattro gradi Celsius durante la notte. Accendere il microscopio e avviare il software di imaging. Fissare la diapositiva sullo stage.
Utilizzare qualsiasi canale per identificare l'area da fotografare. Nel software di imaging, regolare il guadagno e il tempo di esposizione per ciascun canale. Scatta immagini dell'intero tessuto in ciascun canale e unisci le singole tessere per creare un composito dell'intera sezione trasversale TA.
Prima di iniziare, preriscaldare l'acqua priva di RNase a 45 gradi Celsius e preparare etanolo fresco al 70%. Aggiungere 1000 microlitri di tiocianato di guanidinio a ciascuna provetta contenente il campione. È importante che vengano utilizzati tubi approvati da Bead Beater.
Aggiungere tre perline medie, o una grande e una piccola perla, a ciascun tubo. Omogeneizzare il tessuto a 50 Hertz per due o quattro minuti usando un Bead Beater. A seconda del tipo di tessuto e delle dimensioni del campione, potrebbero essere necessari fino a 10 minuti.
aggiungere 200 microlitri di cloroformio. Agitare i campioni per 15 secondi. Incubare per due o tre minuti a temperatura ambiente.
Centrifugare per 15 minuti a 12.000 volte G.Pipettare fuori 350 microlitri del surnatante trasparente e aggiungere a un nuovo tubo micro centrifuga contenente 350 microlitri di etanolo al 70%. Fare attenzione a non aspirare gli strati proteici e/o di DNA inferiori. Trasferire fino a 700 microlitri di questa miscela in una mini colonna di spin posta in un tubo di raccolta da due millilitri.
Continuare con l'isolamento dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore. Elute con 30-50 microlitri di acqua priva di RNasi, a seconda della resa prevista. Mantenere l'RNA sul ghiaccio e misurare la resa utilizzando uno spettrofotometro.
Mantenere l'RNA immagazzinato a meno 80 gradi Celsius. Utilizzare fino a un microgrammo di RNA per sintetizzare il cDNA con un kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore. Al termine della corsa, aggiungere 80 microlitri di acqua priva di RNase.
Conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius. Utilizzando un formato di pozzo 384, aggiungere un microlitro di primer sul fondo di ciascun pozzetto. I primer ad asciugatura libera si traducono in repliche tecniche più strette.
Lasciare coperto fino a quando i primer non sono evaporati completamente. Impostare le reazioni del campione con quattro-otto repliche tecniche. Una volta completata la PCR, normalizzare i valori di soglia del ciclo grezzo ai livelli del gene di pulizia e determinare i cambiamenti di piega calcolando delta-delta Ct.Perilipin e gli adipociti positivi dai TA non fissi hanno alterato significativamente la morfologia rispetto alle sezioni fisse, rendendo la loro identificazione, visualizzazione e una successiva quantificazione molto più difficile e potenzialmente imprecisa.
Al contrario, la fissazione del PFA preserva la morfologia degli adipociti, consentendo un rilevamento accurato del grasso intramuscolare. Rispetto al muscolo TA non ferito, la lesione del glicerolo induce l'espressione di marcatori adipogenici precoci, come PPAR gamma e CEBP alfa non appena tre giorni dopo l'infortunio. Marcatori maturi come adiponectina e perilipina possono essere rilevati già cinque giorni dopo la lesione del glicerolo.
Utilizzando il tracciamento genetico del lignaggio, la maggior parte dei PEP alfa del recettore PDGF esprime il marcatore di lignaggio EYFP. Sette giorni dopo la lesione del glicerolo, i FAP positivi all'EYFP si sono trasformati in perilipina positiva all'EYFP che esprime adipociti, dimostrando che i FAP sono effettivamente l'origine cellulare del grasso intramuscolare. Il protocollo può anche essere adattato per visualizzare il compartimento miogenico.
Utilizzando anticorpi contro PAX7 e MYOD1, rispettivamente i marcatori delle cellule staminali muscolari e dei mioblasti, può essere prontamente rilevato cinque giorni dopo la lesione del glicerolo, anche nelle sezioni fisse del tessuto muscolare PFA. Questo protocollo può anche essere adattato per visualizzare e quantificare gli adipociti e altri tessuti adulti. Inoltre, la nostra tecnica di conservazione dei tessuti è compatibile con la varietà di diverse tecniche in piedi.
