Biz teknik yardım için, yazının eleştirel okuma Ryan Gill Dr Jennifer Emtage teşekkür ve reaktifler için zebra balığı bakımı ve Dr Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) ile yardımcı olur. Çalışmalarımız Bilim ve Teknoloji Temple University College ve Sağlık Ulusal Enstitüsü (R01-HD061749) tarafından desteklenmiştir.

1.. Gen Trap Mikroenjeksiyon F0 Nesil üretimi. AB ve Tübingen suşları yoksul yaşam varken Uzun Fin (TLF) en hoşgörülü olmak - Biz farklı genetik geçmişleri embriyolar pet-mağaza bazlı yabani tip ve Tübingen ile, bu prosedüre farklı tolerans göstermek bulduk. <ol><li> Transpozon DNA&#39;nın hazırlanması. GBT-B1 hazırlayın (pDB783, Balciuniene et al. Hazırlanmasında) standart QIAprep Miniprep kiti (Qiagen 27106) kullanılarak plazmid DNA. Bu başka miniprep DNA transposase mRNA&#39;nın degradasyonuna götüren, RNase A ile kirlenmiş olacaktır, (QIAprep prosedüründe opsiyoneldir) PB yıkama aşamasını içerir için gereklidir. Enjeksiyondan önce, 10 ng / ul RNaz içermeyen su (Ambion AM9937) &#39;de DNA seyreltin. </li><li> Transposase mRNA hazırlanması. Xbal kullanılarak pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 Linearize ve mMessage makine T3 ile doğrusallaştırılmış DNA uyarlamakIn vitro transkripsiyon kiti (Ambion AM1348). Biz RiboLock Rnaz inhibitörü (ThermoFisher Fermentas EO0381) 0.5 ul ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonu değiştirdiniz. DNase işleme aşamasından sonra, bir MinElute RNeasy kiti (Qiagen 74204) kullanılarak mRNA arındırmak. Agaroz jel elektroforezi ile in vitro transkribe edilmiş mRNA kalitesini değerlendirmek. 40 ng / ul RNase-içermeyen su içinde mRNA seyreltin ve mağaza -80 ° C&#39;de 2 ul alikotları olarak </li><li> Mikroenjeksiyon karışımı hazırlanması. Enjeksiyondan önce, transposaz mRNA, 2 ul kısım seyreltilmiş transpozon DNA 8 ul ekleyin. </li><li> Mikroenjeksiyon. Sarısı / blastomere arayüzü için hedefleyen, standart mikroenjeksiyon teknikleri kullanarak 1 hücre Zebra balığı embriyolarının sarısı içine DNA / RNA karışımının 3 nl enjekte edilir. 1 hücreli aşamada embriyolar enjeksiyonu sağlamak için her 20 dakikada bir topla. Bizim tecrübelerimize göre, usta bir kişinin kolayca 1-1.5 saat içinde 1.000 embriyolar enjekte edebilir. </li><li> Enjeksiyonundan sonra, solun 5 ul çalıştırıntransposase mRNA bozulmuş edilmemiştir sağlamak için kalite kontrol için bir% 1 agaroz jeli üzerinde enjeksiyon solüsyonu üzerine. </li><li> Enjekte embriyo bakım. Öğleden sonra, döllenmemiş ve anormal embriyolar kaldırmak ve 100 mm Petri kabı başına 60-80 embriyo dağıtmak. Anormal ve ölü embriyo 1 gün sonrası fertilizasyon (DPF), 2 dpf&#39;e ve 3 dpf&#39;e kaldırılır. </li><li> GFP ekspresyonu için tarama. 3 dpf&#39;e GFP floresan (Şekil 3) için açık kusurları olmaksızın ekran embriyolar. Tarama (biz 5X Fluar amacı ile bir Zeiss AxioImager kullanın) floresan ile donatılmış bir stereomikroskopta ya da yapılabilir (biz Nikon a SMZ1500 kullanın) veya dik bir mikroskop olabilir. Düşük GFP ekspresyonu nedeniyle RNaz kontaminasyon (Şekil 3A) için başarısız enjeksiyon ya da transposase RNA bozulmasını ya da gösterir. F karşılaştırma (çoklu dokularda veya belirli bir doku hücrelerinin bir yüzdesinde GFP ifade var ya da parlak embriyoların yaklaşık% 30 seçinSpesifik olarak Şekil 3B ve 3C). 1.000 embriyoların bir enjeksiyon, genellikle yukarı 100 gelişimsel, normal, yüksek-GFP-ifade embriyolar var. </li><li> Standart Zebra balığı yetiştirme prosedürlerini kullanarak seçilen F0 embriyolar kaldırın. Bu yetiştiriciliği için seçilen enjekte edilen embriyoların% 20-30 yetişkinliğe hayatta olacağını beklemek mantıklıdır. </li></ol> 2. UAS Bakım: MRFP Tester Hattı. Biz bir 14xUAS yarattı: lens özgü γCry damgasını MRFP hattı: GFP. UAS DNA metilasyon yoluyla susturulması tabi olduğundan, stok yaymak susturmanın düzeyi düşük olan balık seçmek önemlidir. <ol><li> Bireysel UAS kurmak: bizim en güvenilir Gal4 gen trap hatlardan biri ile çiftleşme için MRFP homozigot, NSF tpl6 (Balciuniene ark hazırlık.). </li><li> Bir sonraki gün, UAS transferi: embriyolar toplanır ise, tek tek statik tanklara embriyolar vermiştir MRFP balıkve temizlenmelidir. </li><li> 1 dpf&#39;e ve 3 dpf&#39;e GFP ve RFP floresan ekran embriyolar. </li><li> UAS sonraki nesil oluşturmak için yüksek MRFP ifade ile embriyolar verdi melezlemek balık: MRFP hattı. </li></ol> 3. F0 Balık taranması. <ol><li> MRFP balık (Şekil 4): homozigot UAS bireysel F0 çapraz. Biz genellikle yabani tip ya da leopar desenli pigmentasyon çizgiler içine bizim GBTS enjekte ve bizim homozigot UAS: MRFP çizgi pirinç arka planda. Bu nedenle GBT enjekte F0 balık UAS kolayca ayırt edilebilir: MRFP balık, taranmaktadır.İlaç F0 bir erkek ya da bir kadın gibi olup olmadığını kaydetmek için ihtiyacını ortadan kaldırarak kayıt ve / veya cinsiyetini belirleyen hatalarından kaynaklanan olası hatalar Her balık. Çok sınırlı deneyim, bize böyle lisans öğrencileri ile personel bu nedenle kurmak ve balık çiftleşmesi yıkmak edebiliyoruz. Bu yaklaşım iki farklı genetik arka olduğu bir dezavantajı vardırpotansiyel fonksiyon fenotipleri kaybı yorumlanmasını zorlaştıran, kullanılıyor. </li><li> Bir sonraki gün, pirinç UAS dönüş: MRFP balık kendi tankına. Embriyolar toplanır ve taranır ise (biz Hagen Exo Terra Faunarium Küçük kullanılır, ancak herhangi bir küçük tüp, bu amaç için kullanılabilir), ayrı ayrı statik tanklarına embriyolar vermiştir F0 balık yerleştirin. </li><li> Yeni Petri kapları içine temiz ve transfer toplanan embriyoların günün 0 öğleden sonra (tabak başına &lt;100). </li><li> GFP ve RFP floresan 1 dpf&#39;e, 2 dpf&#39;e ve 3 dpf&#39;e için ekran embriyolar. , GFP ve RFP dışarı ikisi için olumlu embriyolar çekin GFP / RFP ifade deseninin tarafından sıralamak (birden fazla model bir kavrama gözlenen ise) ve F1 nesil oluşturmak için onları yükseltmek. </li><li> (50-100 embriyo toplam sayısı dışında) sadece negatif embriyolar üretti F0 balık Euthanize. </li><li> Pozitif bir ikinci parti almak için tekrar GFP / RFP pozitif döl üretilen F0 balık çapraz. </li></ol> 4.F1 Balık taranması. F1 balık, F2 ailelerini kurmak için gen trap ifade deseni belgelemek ve 5 &#39;RACE ve ters PCR ile gen tuzak loci moleküler tanımlanması için embriyo toplu dondurmak için taranmaktadır. <ol><li> MRFP balık (Şekil 4): homozigot UAS bireysel F1 balık çapraz. </li><li> Ertesi gün, embriyolar toplanan ve ekranlı ise bireysel Statik tankların içine embriyolar verdi F1 balık yer. </li><li> GFP ve RFP floresan 1 dpf&#39;e, 2 dpf&#39;e ve 3 dpf&#39;e için ekran embriyolar. GFP ve RFP 24 hem pozitif ayrı ve fotoğraf embriyolar. </li><li> 5 dpf&#39;e, 20 GFP / RFP-pozitif ve 20 GFP / ters PCR ile insertionally mutasyona uğramış genlerin tanımlanması ve 5 için RFP-negatif embriyolar &#39;RACE 9,10 toplu halde dondurma. F2 nesil oluşturmak için kalan GFP / RFP pozitif embriyolar kaldırın. </li></ol>

<ol>
	<li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+trapping+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Enhancer trapping in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> BMC Genomics. 5 (1), 62 (2004).</li><li>Trinh le, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+gene+trap+to+visualize+and+interrogate+the+function+of+the+vertebrate+proteome.">A versatile gene trap to visualize and interrogate the function of the vertebrate proteome.</a> Genes Dev. 25 (21), 2306-2320 (2011).</li><li>Kawakami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transposon-mediated+gene+trap+approach+identifies+developmentally+regulated+genes+in+zebrafish.">A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish.</a> Dev Cell. 7 (1), 133-144 (2004).</li><li>Emelyanov, A., Parinov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mifepristone-inducible+LexPR+system+to+drive+and+control+gene+expression+in+transgenic+zebrafish.">Mifepristone-inducible LexPR system to drive and control gene expression in transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 320 (1), 113-121 (2008).</li><li>Ellingsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+enhancer+detection+in+the+zebrafish+genome.">Large-scale enhancer detection in the zebrafish genome.</a> Development. 132 (17), 3799-3811 (2005).</li><li>Distel, M., Wullimann, M. F., Koster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish.">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13365-13370 (2009).</li><li>Davison, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivation+from+Gal4-VP16+transgenic+insertions+for+tissue-specific+cell+labeling+and+ablation+in+zebrafish.">Transactivation from Gal4-VP16 transgenic insertions for tissue-specific cell labeling and ablation in zebrafish.</a> Dev Biol. 304 (2), 811-824 (2007).</li><li>Sivasubbu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-breaking+transposon+mutagenesis+reveals+an+essential+role+for+histone+H2afza+in+zebrafish+larval+development.">Gene-breaking transposon mutagenesis reveals an essential role for histone H2afza in zebrafish larval development.</a> Mech Dev. 123 (7), 513-529 (2006).</li><li>Clark, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+trapping+produces+a+functional+expression+codex+of+the+vertebrate+proteome.">In vivo protein trapping produces a functional expression codex of the vertebrate proteome.</a> Nat Methods. 8 (6), 506-512 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+response+genetics+in+the+zebrafish.">Nicotine response genetics in the zebrafish.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18662-18667 (2009).</li><li>Gaiano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+mutagenesis+and+rapid+cloning+of+essential+genes+in+zebrafish.">Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish.</a> Nature. 383 (6603), 829-832 (1996).</li><li>Amsterdam, A., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+strategies+in+zebrafish+for+identifying+genes+involved+in+development+and+disease.">Mutagenesis strategies in zebrafish for identifying genes involved in development and disease.</a> Trends Genet. 22 (9), 473-478 (2006).</li><li>Balciunas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+a+high+cargo-capacity+transposon+for+genetic+applications+in+vertebrates.">Harnessing a high cargo-capacity transposon for genetic applications in vertebrates.</a> PLoS Genet. 2 (11), e169 (2006).</li><li>Urasaki, A., Morvan, G., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+dissection+of+the+Tol2+transposable+element+identified+the+minimal+cis-sequence+and+a+highly+repetitive+sequence+in+the+subterminal+region+essential+for+transposition.">Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition.</a> Genetics. 174 (2), 639-649 (2006).</li><li>Haffter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+identification+of+genes+with+unique+and+essential+functions+in+the+development+of+the+zebrafish,+Danio+rerio.">The identification of genes with unique and essential functions in the development of the zebrafish, Danio rerio.</a> Development. 123, 1-36 (1996).</li><li>Amsterdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+315+genes+essential+for+early+zebrafish+development.">Identification of 315 genes essential for early zebrafish development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).</li><li>Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+Gal4-UAS+technique+for+targeted+gene+expression+in+the+zebrafish.">Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish.</a> Mech Dev. 80 (2), 153-158 (1999).</li><li>Koster, R. W., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+transgene+expression+in+living+zebrafish+embryos.">Tracing transgene expression in living zebrafish embryos.</a> Dev Biol. 233 (2), 329-346 (2001).</li><li>Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+double-strand+breaks+into+the+genome+of+mouse+cells+by+expression+of+a+rare-cutting+endonuclease.">Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease.</a> Mol Cell Biol. 14 (12), 8096-8106 (1994).</li><li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish.">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li><li>Lisby, M., Mortensen, U. H., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+multiple+DNA+double-strand+breaks+at+a+single+Rad52+repair+centre.">Colocalization of multiple DNA double-strand breaks at a single Rad52 repair centre.</a> Nat Cell Biol. 5 (6), 572-577 (2003).</li><li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative-NHEJ+is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair.">Alternative-NHEJ is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110 (2008).</li><li>Rehn, K., Wong, K. S., Balciunas, D., Sumanas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+enhancer+trap+line+recapitulates+embryonic+aquaporin+1a+expression+pattern+in+vascular+endothelial+cells.">Zebrafish enhancer trap line recapitulates embryonic aquaporin 1a expression pattern in vascular endothelial cells.</a> Int J Dev Biol. 55 (6), 613-618 (2011).</li><li>Petzold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCORE+imaging:+specimen+in+a+corrected+optical+rotational+enclosure.">SCORE imaging: specimen in a corrected optical rotational enclosure.</a> Zebrafish. 7 (2), 149-154 (2010).</li><li>Akitake, C. M., Macurak, M., Halpern, M. E., Goll, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+analysis+of+transcriptional+silencing+in+zebrafish.">Transgenerational analysis of transcriptional silencing in zebrafish.</a> Dev Biol. 352 (2), 191-201 (2011).</li><li>Boniface, E. J., Lu, J., Victoroff, T., Zhu, M., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FlEx-based+transgenic+reporter+lines+for+visualization+of+Cre+and+Flp+activity+in+live+zebrafish.">FlEx-based transgenic reporter lines for visualization of Cre and Flp activity in live zebrafish.</a> Genesis. 47 (7), 484-491 (2009).</li><li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics.">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36 (6), 543-544 (2004).</li><li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+delivery+and+gene+expression+in+zebrafish+using+the+Sleeping+Beauty+transposon.">Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the Sleeping Beauty transposon.</a> Dev Biol. 263 (2), 191-202 (2003).</li></ol>

Bu yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada açıklanan gen trap vektörler ve metodoloji zaten birkaç bağımsız laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bizim tecrübelerimize göre, süreç içinde iki kritik adımlar vardır. Ilk kritik adım enjekte F0 embriyolarda gen tuzak entegrasyon yüksek oranları elde etmektir. Bu aşamada yetmezliği genellikle enjeksiyon reaktiflerin RNase kirlenmesi özellikle miniprep DNA atfedilebilir. Bu gen trap deneyleri için 1 hücre aşamasında embriyoların enjekte etmek için de çok önemlidir. Bizim tecrübelerimize göre, Tol2-aracılı transgenesis düşük kaliteli DNA ile daha sonra 1 hücre aşamasında veya daha enjekte bile mümkün transgenik çizgiler elde etmek yapım, çok verimli. Gen trap mutajenezini yaparken vektör entegrasyonların sadece küçük bir kısmı etkili bir gen trap olaylarla sonuçlanabilir beri altı enjeksiyonları, çok daha sorunlu. İkinci kritik adım bizim UAS için geçerek gen trap olayları tespit etmektir: MRFP hattı. MRFP ifade yokluğudurhemen hemen her zaman bir arttırıcı tuzak olayın göstergesidir. Bununla birlikte, bazen MRFP ifade eksikliği 14x UAS susturulması gösterebilir. Bu UAS korumak için bu nedenle önemlidir: NSF tpl6 çaprazlandıklarında yüksek TTT ifade ile bireylerin kullanarak nesil yayarak olmayan bir susturulmuş durumda MRFP hattı. Biz gen trap vektörleri ve protokol için çeşitli iyileştirmeler yapmak öngörebiliriz. İlk gen trap yapısı içinde daha az tekrarlanan UAS kullanmaktır. Bu 5x UAS hücre kültürü deneyleri, tam aktivasyon elde edilmesi için yeterli olan ve daha az tekrarlanan UAS dizileri metilasyon ve 6,25 susturma karşı daha az hassas olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, fare gen trap uluslararası konsorsiyum tarafından kullanılan ve yakın zamanda zebrabalıkları 2,26,27 için uyarlanmış vektörlerin benzer şekilde, tam olarak koşullu mutagenez için gen trap vektörlerini tasarlamak mümkün olabilir. Başka bir gelişme, farklı bir t kullanmak olacaktırMRFP muhabir hattı: bir UAS oluşturmak Beauty 28 Sleeping örneğin ransposon sistemi,. Bu doğrudan muhabir hattı ve incrossing tarafından F0s taraması içine Tol2 dayalı gen tuzakları enjeksiyonu sağlayacak. Bundan başka, bu fonksiyon fenotipleri kaybı yorumlanması daha kolay hale iki farklı genetik arka kullanımını ortadan kaldıracaktır. Hatta bu gelişmeler ile, burada sunulan genel Gal4 gen trap protokol hala tam olarak geçerli olacaktır.

Araya sokulan mutajenez fareler ve bitkiler gibi çok hücreli organizmalar bakteri ve maya gibi tek hücreli organizmalardan elde edilen çeşitli model sistemlerinde gen fonksiyonu kesme için güçlü bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Herhangi bir eksojen DNA (virüs, transposon veya plazmit) bu tür ekson veya hızlandırıcılar gibi genlerin temel unsurları kesilmesi ile bir mutajen olarak hizmet edebilir. Ekzonlar tipik omurgalı genomunun sadece% 1-3 ihtiva beri bu tür basit yaklaşımların etkin hedef, büyük ve karmaşık genomlarda derece küçük olduğunu. Zebra balığı 11,12 in retroviral girmeyle mutagenez büyük bir başarı ile örneklendiği gibi küçük etkili bir hedef boyutu, çok yüksek bir entegrasyon vektör oranları ile aşılabilir. Bunun aksine, intronlar omurgalı genomlar yaklaşık% 20-30 içermektedir. Etkili İntronlardaki içine null ya da entegrasyon üzerine şiddetli hypomorphic mutasyonlarm Zebra balığı, geçişken-tabanlı sokma mutajenez vektörter &quot;gen kırma transposo adında edilmiştirns &quot;(GBTS) 8-10. etkin gen tuzak entegrasyon için, bir asgari Tol2 transpozonunda 13,14 kullanabilirsiniz. GBTS arasında Mütajenlik balık kaynaklı bağlantı alıcısı ve transkripsiyon / poliadenilasyon dizilerine dayanır. GBT mutajenlik sorumlu elemanları çevrili bulunmaktadır Cre rekombinaz tarafından eksizyon doğrudan loxP siteleri tarafından. Böylece, Cre mRNA enjeksiyonu bir transposon dizileri entegrasyonu lokusunun 9,10 kalsa da, GBT kaynaklı mutasyonlann etkili bir geri dönmesine yol açar. Son zamanlarda yayınlanan GBT vektörleri iki potansiyel eksiklikleri lider, gen tuzak muhabir 9,10 olarak MRFP kullanın. İlk olarak, doğrudan bir flüoresan raportör füzyon proteinleri ile tespit edilmesi için yeterince yüksek bir düzeyde ifade edilmiştir zebra balığı genlerinin ne fraksiyonu bilinmemektedir. İkinci olarak, genlerin sadece küçük bir alt temel fonksiyonları olması beklenmektedir. Bu Zebra balığı developme için gerekli sadece 1,400-2,400 geni olduğu tahmin edilmektedirnt 15,16. En çok gen trap mutantlan açık fenotipleri görüntülemek için ve bu yüzden sınırlı kullanıma sahip olacaktır beklenmemektedir. Bu iki sınırlamaları aşmak için, primer gen tuzak muhabir olarak Gal4 VP16&#39;ya ile kullanmak için GBT-R15 9,10 değiştirdiyseniz (Balciuniene ark. Hazırlanması). GBT-R15 in Ağustos daha az MRFP olduğu gibi, translasyon başlangıç ​​sitesi Gal4-VP16 çıkarıldı. Gen trap olayların doğrudan saptanması için, lütfen vektörler 14x Gal4 UAS 17,18 kontrolü altında bir raportör eGFP içerir. Çeşitli ek özellikler bizim ikili gen trap vektörü içine tasarlanmıştır. UAS: eGFP kaset doğrudan FRT siteleri (Şekil 1 gri zikzaklar) tarafından kuşatılır. EGFP floresan tarafından işaretlenmemiş gen mutasyonu tuzak bırakarak, eGFP kaset: Flp rekombinazından mRNA enjeksiyon UAS eksizyonu yol açar. Daha sonra GFP floresan ile spesifik dokular veya gelişim olayları işaretlemek transjenik olarak kullanılabilir. Diğer gibiGBTS, bütün gen trap kaseti doğrudan loxp siteleri (Şekil 1 açık pentagons) tarafından kuşatılır. Bu hali hazırda, belirli bir gen trap entegrasyonu arasındaki nedensel ilişkiyi ortaya kurulması ve (Şekil 2) bir fenotip gözlenmiştir, Cre rekombinazın sentezlenmesiyle gen trap etkinlik geri hale getirir. Son olarak, gen trap kaseti ters I-SceI meganuclease siteleri (Şekil 1 &#39;de siyah üçgenler) arasında yer alır. Drosophila olarak, transposon entegrasyonları genellikle P elemanının kesin olmayan eksizyonu kromozom (eksiklikleri) dönüştürülür. Tol2 transposon (veya Güzellik, piggyBac veya Ac / Ds Sleeping gibi omurgalıların aktif başka transposonun) eksizyonu silmeleri yol açabilir dair hiçbir kanıt yoktur. Bu nedenle I-SceI zebrabalıkları silmeleri uyarabilir dair hiçbir kanıt olmamasına rağmen, silme indüksiyonu için potansiyel bir vekil yöntemi olarak I-SceI siteleri dahil. Belirtilmelidir ki iken I-SceI meganükleaz Zebrafish transgenesis kolaylaştırmak için kullanılabilir, I-SceI meganuclease by DNA bölünme DNA onarımı, mayada hata eğilimli homolog olmayan uç birleştirme mekanizmaları da dahil olmak üzere, ve memeli hücreleri 19-22 çalışma için kullanılır. Bizim gen trap vektörü entegrasyonu iki farklı mekanizma ile EGFP ifade yol açabilir. Birincisi, gerçek gen trap olayı (Şekil 1C) &#39;dir: vektör, bir gen (Insertionally mutasyona uğramış gen için IMG), endojen IMG transkript ve Gal4-VP16 5&#39; arasında bir füzyon transkripti içine entegre olarak yapılan ve çevrilmiştir IMG ve Gal4-VP16 tarafından kodlanan proteinin N-terminalini içeren bir füzyon proteini. Bu füzyon proteini, 14x UAS bağlanan ve eGFP transkripsiyonunu aktive eder. İkinci, daha az arzu edilen etkinlik arttırıcı bir tuzak (Şekil 1D) olup: eGFP önünde minimal promoter ab EGFP üretimine yol açan, entegrasyon bölgesine yakın bir arttırıcının kontrolü altında düştüğündeGal4-VP16 üretim sence. Bizim tahmin olarak, EGFP ifade olayların% 30-50 bir güçlendirici tuzak nedeniyle ve% 50-70 bir gen tuzak 23 kaynaklanmaktadır (Balciuniene et al. Hazırlık). MRFP transgenik hat (Şekil 1B), lens spesifik γCry ile işaretlenmiş kolaylık sağlamak için: (. Balciuniene et al hazırlanmasında) GFP etkinlikleri bu iki sınıfın arasında ayrım yapmak için, bir 14xUAS yaptık. Gene tuzak etkinlik GFP ko-ekspresyonu ve RFP (Şekil 2&#39;deki C ve D karşılaştırın) ile doğrulanır. Pilot ekranında, transpozon DNA ve transposase mRNA karışımı enjekte 270 F0 balık eleme, 40 den fazla gen trap olayları iyileşti. NSF ve KAT: bizim gen trap entegrasyonlar İki önceden yayınlanmış kimyasal kaynaklı mutantlar ile genlerin içine meydana gelmiştir. Bizim insersiyonel mutantlar NSF tpl6 ve flr tpl24 fenotipleri fenotipten yüzeysel ayırt edilemezkarşılık gelen kimyasal kaynaklı mutantlarının s. Ayrıca, gen trap Olayları, böylece boş alelin olasılığını artırarak, genlerin 5 &#39;ucuna yakın bir intron doğru bastırılmaktadır görünür olduğunu belirtti. Biz gen trap hatları tüm UAS susturma (renklilik) bir dereceye gözlemlemek yapmak ve bazı loci açıkça diğerlerinden daha renklilik daha yatkındır. Biz kolayca tek başına GFP ifade seçerek en az beş nesil boyunca bizim gen tuzak hatları tüm yaymak mümkün olmuştur gibi UAS susturulması, gen tuzak hatları yayılması için önemli bir sorun olduğunu inanmıyorum.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog #</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Miniprep Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>27104</td>
 <td>Optional PB wash step is a must</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>XbaI restriction enzyme</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>ER0681</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mMessage Machine T3</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM1348</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RiboLock RNase Inhibitor</td>
 <td>ThermoFisher</td>
 <td>EO0381</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RNeasy MinElute</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>74204</td>
 <td>Can be replaced by phenol extraction 			and precipitation. Do not use LiCl!</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nuclease-free water</td>
 <td>Ambion</td>
 <td>AM9937</td>
 <td>Has to be non-DEPC treated</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass capiliaries for 			microinjection needles</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>1B100F-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microcapiliaries for calibration</td>
 <td>Drummond Scientific </td>
 <td>1-000-0010</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microloader tips</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>5242 956.003</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle puller *</td>
 <td>Sutter Instruments</td>
 <td>P-87</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Stereomicroscope 			for microinjection * </td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td>We also use Wild 5M and Olympus SZ61 			with transmitted light stand</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Picoinjector *</td>
 <td>Harvard Instruments</td>
 <td>Pli-90</td>
 <td>We also use Pli-100</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>Zeiss AxioImager</td>
 <td>5X Fluar objective has sufficient 			working distance</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Screening microscope with GFP/RFP 			fluorescence *</td>
 <td>Nikon </td>
 <td>SMZ1500</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>* We suggest this equipment only because we successfully use it in our laboratory. In each category, several comparable options from multiple manufacturers are available.</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

gene trapping using gal4 in zebrafish

Büyük debriyaj boyutu ve optik şeffaf embriyoların dış geliştirme Zebra balığı mutasyona uğramış genlerin ifadesini etiketlemek için floresan gazetecilere kullanarak in vivo ekleme mütajenezi için olağanüstü omurgalı bir model sistem yapmak. Bazı laboratuarlar muhabir 1-7 gibi floresan proteinleri, Gal4-ve lexA bazlı transkripsiyonel aktivatörleri kullanarak Zebrafish güçlendirici ve gen trap vektörleri inşa edilmiş ve test edilmiştir. Ve düşük mutajenlik (nadiren null alleli üretilen genlerin içine örneğin entegrasyonları) bırakıyorsa sıkılık (arttırıcı-ve gen-tuzak olaylar arasında ayrım yeteneği örneğin eksikliği): Bu vektörler iki potansiyel sakıncaları vardı. Gene Breaking Transposon (GBTS) bu sakıncaları 8-10 gidermek için geliştirilmiştir. Gen trap olayların doğrudan saptanması için ikincil raportör olarak EGFP: Bu primer gen trap muhabir ve ilave UAS olarak Gal4-VP16 ile kullanım için, ilk GBT vektörlerin biri, GBT-R15 olarak var. Aprimer gen tuzak muhabir olarak Gal4 VP16&#39;nın pplication iki ana avantaj sağlar. İlk olarak, düşük seviyelerde ekspresyon sentezlenen genler için duyarlılığını arttırır. İkinci olarak, çok özel dokularda diğer transgenlerin direkt ifade için Gal4 sürücüler olarak gen trap hatları kullanımı araştırmacılar sağlar. Bu gen tuzak entegrasyon aleni fenotiplerinde neden olmayabilir gerekli olmayan veya gereksiz fonksiyonları ile genler için özellikle uygun olduğunu. Primer gen trap muhabir olarak Gal4-VP16 kullanmanın dezavantajı, elde edilen Gal4-VP16 füzyon proteinleri çekirdeğe girmek için mümkün olası değildir ve aktive gibi N-terminal sinyal sekansları ile proteinleri kodlayan genler, hapsi için uygun olmamasıdır transkripsiyon. Önemli olarak, Gal4-VP16 kullanımı nükleer proteinler için önceden seçmez: Biz çekirdeği, sitoplazma ve plazma membranında işlev proteinlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlar gen trap iyileşti.

Başarılı bir enjeksiyon olarak, embriyoların en az% 80 GFP floresan bir dereceye kadar (Şekil 3) görüntüler gen trap DNA / Tol2 transposase mRNA karışımı ile enjekte edilir. En parlak GFP-pozitif embriyolar (Şekil 3C), F0 havuzu oluşturmak için seçilen zaman yaklaşık 10 filtrelenmiş F0 balık gen trap soyu verecektir. Gen trap etkinlik elde edilir hangi F0 balık arasında, en çok olmayan çeşitli ifade transposon entegrasyonlar ek olarak, tek bir gen trap etkinliği iletir. Ancak, biz bir tek F0 kişiden dört gen tuzak hatlarına kadar kurduk. Gen trap çizgilerle GFP / RFP ekspresyon modelleri (koku ampuller, örneğin), son derece spesifik doku için, her yerde arasında değişir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Şekil 1. To-içeren GAL4 ikili gen trap vektör GBT-B1 ve uygulamaları. A. Gal4 içeren gen tuzak vektör Bileşenleri: Tol2 5 &#39;ve Tol2 3&#39;, minimal Tol2 transposon 13 biter; CSA, Carp β-Aktin bağlayıcı alıcı 8; ^ Gal4-VP16, Ağustos-az Gal4-VP16; zp ( GBT-R15 9,10 A), zebra balığı β-aktin 3 &#39;UTR ve poli (A) elemanları. EGFP ifade kaseti 17,18: 14XUAS, eGFP ve SV40 p (A) UAS bileşenleridir. Ok UAS aktivasyonunu gösterir: gen tuzak tarafından üretilen Gal4 VP16&#39;ya tarafından eGFP B. 14XUAS:. GFP kaset: mercek özgü γCry damgasını MRFP transgen. Ok UAS aktivasyonunu gösterir: MRFP Gal4 VP16&#39;ya trans C. Gen tuzak olay.. Mavi renkli kutular eksonları bulunmaktadır. Yapıştırma kesikli çizgi. D. Artırıcı tuzak olayı ile gösterilir. Bir arttırıcı (kahverengi kutu) yakın vektörün entegrasyonu kahverengi bir ok (bu arttırıcının kontrolü altında asgari eGFP destekleyici yerleştirebilir.) Bu eGFP bir dokuya özel ekspresyon olmasına neden olur, ancak Gal4-VP16 yapılmaz, çünkü MRFP ifade aktif olmayacaktır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Şekil 2. Cre rekombinaz kullanılarak gen trap etkinlikleri dönme. Bir gen trap mutasyon (A) ve Cre-döndürüldü gen trap alel (B) A, B, diyagramı. C, D. GFP (C) &#39;nin ifadesi ve Co-NSF tpl6 geninin sinir sisteminde RFP (D) tuzak hattı. E, NSF tpl6 embriyolara Cre RNA F. Enjeksiyon GFP (E) kaybı ve TTT (F) ifade yol açar. Beklendiği gibi lens GFP ifade herhangi bir azalma, var olduğuna dikkat edin. Şekil 3,. Tünelin-B1 (pDB783) geni kapanı ile enjekte embriyolar. . Embriyo rastgele bir grubu (B) ve yetiştirme için seçilen yüksek expressors: A. embriyolar pGBT-B1 (pDB783) gövde B&#39;de tek başına görüntü az GFP floresan enjekte edilmiş, C. embriyolar pGBT-B1 ve Tol2 transposase mRNA enjekte (C). <img alt="Şekil 4," fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Şekil 4. Gal4 gen trap hatlarının kurulması için deneysel anahat. Yalnız yeşil gen trap veya arttırıcı tuzak olaylar için Mozaiklik gösterir iken Parçalı örtüşen kırmızı / yeşil yapılar, GFP ve RFP&#39;nin ortak ifadesini gösterir.

Watch this Scientific Journal Video about Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish at JoVE.com

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Bu protokol Zebrafish ikincil muhabir olarak birincil ve GFP raportör / RFP olarak Gal4-VP16 kullanılarak gen trap girmeyle mutagenez yöntemini anlatır. Yaklaşık bir yüksek ifade F0 balık verim gen trap döl GFP ve RFP co-ifade on. Tarama prosedürü kolayca sokma mutajenez ekranını performans laboratuvar boyutuna uyum ölçekli olabilir.

Zebra balığı Gal4 kullanma Gene Yakalama

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Görüntüleme.  Temple University.  Bu protokol Zebrafish ikincil muhabir olarak birincil ve GFP raportör / RFP olarak Gal4-VP16 kullanılarak gen trap girmeyle mutagenez yöntemini anlatır. Yaklaşık bir yüksek ifade F0 balık verim gen trap döl GFP ve RFP co-ifade on. Tarama prosedürü kolayca sokma mutajenez ekranını performans laboratuvar boyutuna uyum ölçekli olabilir. 

Video: Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Gen Fonksiyon Analiz Zebra balığı Embriyolar Mikroenjeksiyon

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Biyoloji

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Induction and Testing of Hypoxia in Cell Culture

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells. This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in oxygen (causes include insufficient blood vessel network, defective blood vessel, and anemia) or to an increased consumption of oxygen relative to the supply (caused by a sudden higher cell proliferation rate). Hypoxia can be physiologic or pathologic such as in solid cancers 1-3, rheumatoid arthritis, atherosclerosis etc&#x2026; Each tissues and cells have a different ability to adapt to this new condition. During hypoxia, hypoxia inducible factor alpha (HIF) is stabilized and regulates various genes such as those involved in angiogenesis or transport of oxygen 4. The stabilization of this protein is a hallmark of hypoxia, therefore detecting HIF is routinely used to screen for hypoxia 5-7. 
In this article, we propose two simple methods to induce hypoxia in mammalian cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of these cells.

Here we propose simple methods to induce hypoxia in cell cultures and simple tests to evaluate the hypoxic status of the cultures.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Hypoxia is defined as the reduction or lack of oxygen in organs, tissues, or cells.  This decrease of oxygen tension can be due to a reduced supply in ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Morpholinos in vivo Elektroporasyon Yetişkin Zebra balığı Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Yetişkin Zebra balığı Gavaging

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic tools have been introduced, including multiple strategies for inducing mutations and generating transgenic lines. However, large-scale screening is limited by traditional genotyping methods, which are time-consuming and labor-intensive. Here we describe a technique to analyze zebrafish genotypes by PCR combined with high-resolution melting analysis (HRMA).&#160;This approach is rapid, sensitive, and inexpensive, with lower risk of contamination artifacts.&#160;Genotyping by PCR with HRMA can be used for embryos or adult fish, including in high-throughput screening protocols.

PCR combined with high-resolution melt analysis (HRMA) is demonstrated as a rapid and efficient method to genotype zebrafish.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...