Burada açıklanan protokol, yüksek ofloksasin tedavisinden sonra Escherichia coli persister hücrelerini karakterize etmek için klasik mikrobiyoloji tahlillerini tek hücreli canlı görüntüleme ile birleştiren bütünleştirici bir yöntem sunmaktadır. Bu tekniğin temel avantajı, kalıcılık fenomenini popülasyonda ve tek hücre düzeyinde analiz etmektir. Popülasyon ve tek hücreli analizin birleştirilmesi, kalıcılık fenotipinin moleküler ve hücresel karakterizasyonuna izin verir.
Başlamak için, ilgilenilen bakteri suşunu bir LB agar plakası üzerindeki donmuş bir gliserol stoğundan çizin ve tek koloniler elde etmek için 15 ila 19 saatlik bir süre boyunca gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İzole edilmiş bir koloniyi,% 0.4 glikoz ile desteklenmiş beş mililitre MOPS büyüme ortamı içeren bir cam tüpte aşılayın ve gerekirse ortama seçici bir antibiyotik ekleyin. Tüpü gece boyunca 37 santigrat derece ve 180 rpm'de çalkalayan bir inkübatöre yerleştirin.
Ertesi gün, hücreleri pelet etmek için bir mililitre kültürü 2.300 g'da üç dakika boyunca santrifüj edin ve peleti aynı miktarda PBS ile hafifçe askıya alın. OD'yi 600 nanometrede ölçün ve iki mililitrelik son hacimde 0.01'lik bir başlangıç OD600 için gereken hacmi hesaplayın. Daha sonra, iki mililitre MOPS gliserol% 0.4 orta kısmı şeffaf tabanlı, 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna ekleyin ve hesaplanan gece kültür hacmi ile aşılayın.
OD600'ü 24 saat boyunca izlemek için 24 delikli plakayı otomatik bir mikro plaka okuyucuya yerleştirin. Mikroplaka okuyucuyu, OD600'ü her 15 dakikada bir 37 santigrat derece sıcaklıkta ve 140 rpm'lik yüksek yörüngesel dönüşle ölçecek şekilde ayarlayın. 100 mililitre LB agar'ı eritin ve katılaşmayı önlemek için şişeyi 55 santigrat derecede stoklayın.
Altı küçük cam şişe hazırlayın ve steril bir pipet kullanarak her şişeye beş mililitre sıvı LB agar ortamını pipetin. Mililitre ofloksasin stok çözeltisi başına beş miligramdan 10 mikrolitre alın ve 90 mikrolitre ultra saf suda seyreltin. Mililitre ofloksasin başına sıfır ila 0.1 mikrogram nihai konsantrasyon elde etmek için LB agar ortamı içeren altı cam şişenin her birine seyreltilmiş ofloksasinin artan hacimlerini ekleyin.
Şişeleri birkaç kez döndürerek çözeltiyi karıştırın ve antibiyotik eklenmiş LB agar ortamını altı delikli bir kültür plakasına dökün. Agarın katılaşana kadar soğumasını bekleyin ve kullanmadan önce plakayı kurutun. PBS ile bir gecelik bakteri kültürünü, mililitre başına yedinci CFU'nun bir katı 10 ila yedinci CFU'luk bir nihai hücre yoğunluğuna seyreltin.
Kurutulmuş altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna iki mikrolitre seyreltilmiş kültür yerleştirin. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirmeden önce lekelerin kurumasını bekleyin. Ertesi gün, hangi ofloksasin konsantrasyonunda bakteri kolonilerinin büyümesinin engellendiğini kontrol edin.
Hazırlanan LB agarının yaklaşık 25 mililitresini bir Petri kabına dökün. Ardından, her katılaşmış ve kurutulmuş plakaya beş ila sekiz steril cam boncuk ekleyin. Plakaları ters çevirin ve etiketleyin.
Daha sonra, 900 mikrolitre 0.01-molar magnezyum sülfat çözeltisi içeren on kat seri seyreltme cam tüpleri hazırlayın. Bir cam tüpte, bir gecelik kültürü taze ve sıcaklık ayarlı ortamda yaklaşık 0.001'lik nihai bir OD600'e seyreltin ve kültürün bir inkübatörde gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, OD600 0.3'e ulaştığında, spot tahlil verilerine göre seyreltme için 100 mikrolitre kültür aktarın.
Bakteri kültürünün on kat seri seyreltmesini gerçekleştirin. Daha sonra hazırlanan LB agar plakaları üzerine seyreltilmiş kültürün 100 mikrolitresini plakalayın. İstenilen ofloksasin konsantrasyonunu bakteri kültürüne ekleyin ve sallarken 37 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin.
İlgili zaman noktalarında, kültürün 100 mikrolitresini geri çekin ve kültürü spot tahlil verilerine göre seyreltin. LB agar plakaları üzerinde seyreltilmiş kültürün 100 mikrolitresini plakalayın. Ertesi gün, gece boyunca inkübe edilen plakaların kolonilerini, kolonilerin tespit edilebileceği en yüksek iki seyreltmede sayın.
T0'da mililitre başına CFU'daki her zaman noktasında mililitre başına CFU'yu normalleştirerek hayatta kalma oranını hesaplayın ve günlük tabanı 10 normalleştirilmiş değerini zamanın bir fonksiyonu olarak çizin. Koruma çözeltisini mikroakışkan plakanın her bir kuyucuğundan çıkarın ve taze kültür ortamı ile değiştirin. Mühürle düğmesine tıklayarak veya mikroakışkan yazılım aracılığıyla mikroakışkan plakayı manifold sistemi ile kapatın.
Ardından, mikroakışkan yazılım arayüzünde, Run Liquid Astarlama Sequence'a tıklayarak ilk astarlama sırasını gerçekleştirin. Mikroskopi görüntülemeye başlamadan önce plakayı termostatik olarak kontrol edilen bir mikroskop kabininde 37 santigrat derecede en az iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, denemeye başlamadan önce ikinci bir Sıvı Hazırlama Sırası Çalıştır başlatın.
Mikroakışkan yazılım arayüzündeki Unseal Plate (Mühürü Kaldır Plakası) seçeneğine tıklayarak mikroakışkan plakayı kapatın. Kuyucuklardaki ortamı 200 mikrolitre taze ortam, taze ortam içeren antibiyotik ve taze ortamda 0.01 OD seyreltilmiş kültür örneği ile değiştirin. Mikroakışkan plakayı daha önce gösterildiği gibi kapattıktan sonra, plakayı mikroskop dolabının içindeki mikroskop hedefine yerleştirin.
Mikroakışkan yazılımda, hücrelerin mikroakışkan plakaya yüklenmesine izin vermek için Hücre Yükleme Sırasını Çalıştır'a tıklayın. İletilen ışık modunu kullanarak en uygun odağı ayarlayın ve alan başına 300 hücreye kadar uygun bir hücre sayısının gözlemlenebileceği birkaç ilgi alanı seçin. Mikroakışkan yazılımda, taze ortamın enjeksiyonunu altı saat boyunca 6.9 kilopaskalda bir ve iki kuyuya programlamak için Özel Bir Dizi Çalıştır'ı, ardından 6.9 kilopaskalda antibiyotik içeren ortamı veya altı saatte üç kuyuya ve son olarak 6.9 kilopaskaldaki taze ortamı 24 saat boyunca dört ve beş kuyuya kadar düzenleyin.
İletilen ışığı ve floresan muhabir için uyarma ışık kaynağını kullanarak her 15 dakikada bir kare ile hızlandırılmış modda mikroskopi görüntüleme gerçekleştirin ve mikroakışkan programı başlatın. Bilgisayarda ImageJ veya Fiji yazılımını açın ve hiperstack hızlandırılmış mikroskopi görüntülerini Fiji yükleme çubuğuna sürükleyin. Hiperstack'in farklı kanallarını birleştirmek için Image'ı, ardından Color'ı ve ardından Make Composite'i kullanın.
Kanallar istenen renge karşılık gelmiyorsa Görüntü, Renk ve ardından Kanalları Düzenle'yi kullanın. MicrobeJ eklentisini açın ve manuel düzenleme arayüzünü kullanarak bakteri hücrelerini tespit edin. Otomatik olarak algılanan hücreleri silin ve ilgilenilen kalıcı hücreleri kare kare el ile ana hatlarıyla belirtin.
Algılamadan sonra, bir ResultJ tablosu oluşturmak için MicrobeJ manuel düzenleme arayüzündeki Sonuç simgesini kullanın. Tek hücreli analizin ilgilenilen farklı parametrelerine ilişkin içgörüler elde etmek için ResultJ tablosunu kullanın ve ResultJ dosyasını kaydedin. Her iki suş için ofloksasinin MIC'sinin mililitre başına 0.06 mikrogram olduğu belirlenmiştir, bu da hupA-mCherry füzyonunun izojenik vahşi tip suşa kıyasla ofloksasinin duyarlılığını etkilemediğini göstermektedir.
Nokta testi, zaman içinde uygun seyreltmelerde izole klonları gösterdi, örneğin, sıfır zamanında negatif beşinci seyreltme ile 10 arasında. Zaman öldürme analizinde, ilk eğimin kalıcı olmayan popülasyonun hızlı bir şekilde öldürülmesini yansıttığı tipik bir bifazik eğri gözlenmiştir. İkinci aşama, ilaca toleranslı kalıcı hücrelerin varlığını ortaya çıkaran daha yavaş bir öldürme oranı gösterdi.
Özellikle, zaman öldürme eğrisi, hupA-mCherry füzyon proteininin zaman öldürücü kinetiği etkilemediğini göstermektedir. Mikroakışkan deneyde, ilk büyüme aşaması, ofloksasin tedavisinden önce hücrelerin canlı olduğunu ve bölündüğünü gösterir. Bu ilk büyüme aşamasından sonra, antibiyotik hücrelere ulaşır ulaşmaz hücre bölünmesi engellendi.
Ofloksasin tedavisinden sonra, taze ortam ile perfüzyonda, hücrelerin büyük çoğunluğu büyümeye devam edememiştir. Buna karşılık, küçük bir alt popülasyon, kalıcı hücreler olarak tanımlanan filamentli hücreleri uzatabilir ve üretebilir. Bölünen kalıcı filament, çoğu tedavi edilmemiş hücrelere benzer şekilde büyümeye ve bölünmeye başlayan çoklu yavru hücreler üretti.
Hücre uzunluğundaki artış, replikasyonun yeniden başlatılmasını ve nükleoid bolluğundaki artışı yansıtan toplam mCherry floresan yoğunluğundaki bir artışla korelasyon gösterdi. Kalıcılığı incelemek için hücre içi bir muhabir içeren bir suş kullanıldığında, muhabirin varlığının vahşi tip bir suşa kıyasla büyümeye, MIC'ye ve öldürmeye müdahale etmediği emperyaldir. Burada açıklanan prosedür, değişen ortamlara veya streslere hücresel tepkileri izlemek için diğer koşullara ve bakteri türlerine uygulanabilir.
Aynı kurulumda diğer floresan muhabirleri kullanarak, kalıcı hücrelerin fizyolojisine yeni bakış açıları araştırılabilir.
