Burada açıklanan protokol, bakteri kalıcılığını yüksek verimli bir şekilde önemli ölçüde etkileyebilecek koşulları tanımlamayı mümkün kılar. Bu yöntem, ilaç panelleri, gen kütüphaneleri ve daha fazlası gibi çeşitli alanlar için taramaya kolayca uyarlanabilir. Yöntem, aynı anda gerçekleştirilecek çeşitli alt adımları içerdiği için, görsel gösterim araştırmacıların kesin sonuçlar elde etmek için zamanlamalarını yönetmelerine yardımcı olabilir.
Mikroarray hücre kültürleri hazırlayarak başlayın. 250 mikrolitre üstel faz hücresini 50 mililitrelik santrifüj tüpünde 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Daha sonra hücre süspansiyonu homojen hale getirmek için hafifçe karıştırın.
Seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir 50 mililitrelik rezervuara aktarın. Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunun 150 mikrolitresini çeşitli kimyasallar içeren bir mikroarray plakasının her kuyusuna aktarın. Mikroarraylar, metin el yazmasında açıklanan yöntemi izleyerek manuel olarak da oluşturulabilir.
Mikroarray plakasını gaz geçirgen tavan zarı ile örtün ve 37 santigrat derece ve 250 RPM'de 24 saat boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Daha kalıcı test plakaları yapmak için, 50 mililitre santrifüj tüpünde mililitre Ofloksasin başına beş mikrogram içeren 25 mililitre modifiye LB ortamı hazırlayın ve bu ortamı steril bir rezervuara aktarın. Modifiye LB ortamının 190 mikrolitresini genel bir düz alt 96 kuyu plakasının her kuyusuna aktarın.
24 saatlik inkübasyondan sonra, mikroarray'ı çalkalayıcıdan çıkarın ve 10 mikrolitre hücre kültürünü mikroarraydan Ofloxacin ile modifiye LB ortamı içeren kalıcı test plakasının kuyularına aktarın. Kalıcı deneme plakasından 10 mikrolitre hücre süspansiyonu alın ve yuvarlak bir alt 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanarak 290 mikrolitre PBS çözeltisinde üç kez seri olarak seyreltin. Daha sonra antibiyotik içermeyen taze agar plakalarında seri olarak seyreltilmiş tüm hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini tespit edin.
Kalıcı test plakasını gaz geçirgen tavan zarı ile örtün ve altı saat boyunca 37 santigrat derece ve 250 RPM'de bir yörünge çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Altı saatlik inkübasyondan sonra, seri seyreltme ve lekelenmeyi agar plakalarında tekrarlayın. Agar plakalarını 37 santigrat derecede 16 saat kuluçkaya yatırın.
Daha sonra koloni oluşturan birimleri veya CFO'ları sayın. Her kuyudaki kalıcı fraksiyonu hesaplamak için antibiyotik tedavisinden önce ve altı saat sonra CFU seviyelerini kullanın. OFX tedavisinden önce CFU sayar, osmolites'in e coli canlılığı üzerindeki etkilerini değerlendirmeye de yardımcı yardımcıdır.
250 mikrolitre üstel faz hücresini mikroarray taramasından tanımlanan osmolit içeren 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın. Matarayı 250 RPM ve 37 santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda 24 saat boyunca kuluçkaya yatır. 24 saat sonra şişeyi çalkalayıcıdan çıkarın ve hücre kültürünün 250 mikrolitresini 250 mililitrelik şaşkın bir şişede 25 mililitre taze modifiye LB ortamına aktarın.
Hücre süspansiyonu için 25 mikrolitre Ofloxacin stok çözeltisi ekleyin ve tahlil kültürünü homojen hale getirmek için şişeyi hafifçe sallayın. Şişeyi 37 santigrat derece ve 250 RPM'de bir çalkalayıcıda kuluçkaya yatırın. Tedavi sırasında her saat, Ofloxacin'in eklenmesinden önceki bir zaman noktası da dahil olmak üzere, test kültürünün bir mililitresini şişeden 1,5 mililitre mikro santrifüj tüpüne aktarın ve üç dakika boyunca 17.000 kez G'de santrifüjleyin.
950 mikrolitre süpernatantı çıkarın ve hücreleri 950 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, hücre peletini 100 mikrolitre PBS çözeltisinde yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini alın ve 96 kuyu yuvarlak alt plakanın içinde 90 mikrolitre PBS ile altı kez seri olarak seyreltin.
Seyreltilmiş hücre süspansiyonlarının 10 mikrolitresini antibiyotiksiz bir agar plakasında tespit edin. Algılama sınırını artırmak için, kalan 90 mikrolitre hücre süspansiyonunun plakasını taze bir agar plakasına koyun. Plakaları 16 saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, sonra CFO'ları sayın.
OFX tedavisinden önce ve sonra hücre kültürlerinin CFU seviyelerini belirlemek için kullanılan agar plakalarının temsili bir görüntüsü burada gösterilmiştir. İlk sütun denetim grubudur. İkinci sütunda 100 milimoler sodyum nitratta kültürlenmiş hücreler, üçüncü sütunda ise 60 milimoler sodyum nitratta kültürlenmiş hücreler bulunmaktadır.
Basitlik için, sadece iki osmolites buraya odaklanmıştır. 96 kuyu plakasında test edilen hücre kültürlerinin plakalarından ve kalıcı fraksiyonlarından alınan CFU verilerinin grafiksel bir gösterimi burada gösterilmiştir. Fraksiyonları hesaplamak için, kalıcı sayımlar antibiyotik tedavisinden önce elde edilen hücre sayılarına normalleştirildi.
Byphasic kill eğrileri oluşturmak için, hücreler belirtilen osmolitler ve şaşkın şişelerle 24 saat boyunca 25 mililitre değiştirilmiş LB ortamında kültürlendi, daha sonra kalıcı numaralandırma için kalıcı test şişelerine aktarıldı. Bu protokolü denerken, agar plakasındaki hücreleri tespit etmenin emek yoğun olduğunu ve odaklanma gerektirdiğini unutmayın. Adım sırasındaki bir hata, test edilen koşullar arasında çapraz kontaminasyona neden olabilir.
Bu nedenle, deneyden önce aynı anda birden fazla örneği tespit etmek önemlidir. Bu protokolün ardından, kalıcılık üzerindeki etkileri incelemek için ilaç panelleri ve mutant hücre kütüphaneleri taranabilir. Bu tarama ile bakteriyel kalıcılık üzerinde önemli bir etkiye sahip bir dizi osmolite ve PS durumu belirledik.
