Bu protokol, SPH CRISPR Aktivasyon Sistemini, adipositlerde kazanç fonksiyonu testleri yapmak için geleneksel viral vektörlere alternatif bir strateji olarak sunmaktadır. Adino ilişkili bir virüs kullanarak özelleştirilmiş tek kılavuzlu RNA vererek, yağ dokusunun karmaşık hücresel ortamında tek veya çoklu adiposit endojen genlerinin aşırı ekspresyonuna izin verir. Bu protokolün zorlu adımları, tek kılavuz RNA'nın klonlanması ve adeno ilişkili virüsün yağ dokusuna üretilmesi ve enjekte edilmesi ile ilgilidir.
Başlamak için, chopchop veya başka bir uygun alet kullanarak CRISPR aktivasyonu için tek kılavuzlu RNA veya sgRNA tasarlayın. Aşağıdaki parametreleri kullanarak PRDM16 genini hedefleyen sgRNA'yı tasarlayın:Bir CRISPR / Cas9 kullanarak ve aktivasyon olarak bir Mus kaslarında PRDM16 olarak hedefleyin. Vektör omurgası PAAVU6GRNACBHM kirazındaki Sac1 kısıtlama bölgesini eşleştirmek için sgRNA'ya çıkıntılar ekleyin.
5'AGCT 3'ü dahil edin, burada n nükleotitlere karşılık gelir. Belirtilen aracı kullanarak 3'sgRNA ters kompleman dizisi elde edin. Daha sonra, tek sarmallı ücretsiz oligonükleotidlerin tavlanması için, her 5've 3' tek sarmallı oligonükleotidin bir mikrolitresi, bir mikrolitre T4 ligaz tamponu, 0.5 mikrolitre T4 polinükleotid kinaz ve 10 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmi için 6.5 mikrolitre su ekleyin.
Ücretsiz tek sarmallı oligonükleotidleri, 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede ve beş dakika boyunca 95 santigrat derecede bir termosiklet kullanarak tavlayın, ardından dakikada beş santigrat derece rampa düşürme oranı izleyin. Daha sonra tavlanmış sgRNA oligonükleotidlerin ligasyonu için, iki mikrolitre tavlanmış sgRNA Oligonükleotid, bir mikrolitre Sac1 enzimi, iki mikrolitre 10X T4 DNA ligaz tamponu, bir mikrolitre T4 DNA ligaz ve suya 10 mikrolitrelik bir son reaksiyon hacmine 25 nanogram plazmid PAAVU6GRNACBHM kirazı ekleyin. Bir termosiklet kullanarak, reaksiyon karışımını beş dakika boyunca 37 santigrat derecede 15 döngü ve beş dakika boyunca 25 santigrat derecede inkübe ederek ve ardından dört santigrat derecede tutarak ligasyon gerçekleştirin.
Daha sonra, yetkili Escherichia coli DH10B hücrelerini, ligasyon ürününün dört mikrolitresi ile 42 santigrat derecede 45 saniye boyunca ısı şoku ile dönüştürün ve mililitre Ampisilin başına 10 mikrogram içeren bir agar plakasına yayın. PCR Master Mix'i kullanarak Koloni Polimeraz Zincir Reaksiyonu veya PCR ile dönüştürülmüş kolonileri onaylayın, koloni seçin ve beş mikrolitre Master Mix, 0.1 mikrolitre evrensel astar, 0.1 mikrolitre sgRNA ters astar ve beş mikrolitre su ile karıştırın. PCR'yi iki dakika boyunca 94 santigrat derecede ilk denatürasyon, ardından 20 saniye boyunca 94 santigrat derecede 35 döngü denatürasyon, 60 santigrat derecede 30 saniye tavlama, 30 saniye boyunca 72 santigrat derecede uzatma ve beş dakika boyunca 72 santigrat derecede son bir uzama adımı kullanarak çalıştırın.
PCR'den sonra, DNA'yı 30 dakika boyunca 90 voltta 0.5X TAE Tamponunda agaroz jel elektroforezi kullanarak çözün. Universal astar kullanarak Sanger Dizilimi için pozitif örnekler gönderin. Daha sonra, üreticinin talimatlarını izleyerek bir plazmid saflaştırma kiti kullanarak plazmidi pozitif bir klondan arındırın.
Anestezi uygulanan fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin ve kasık beyazı yağ dokusu veya tıraş makinesi ile IWAT enjeksiyonları için kalça eklemlerine yakın yanlarda küçük bir alanı tıraş edin. Beş dakika boyunca tüy dökücü krem ekleyin. Cilt yanıklarını önlemek için kalan kremi suyla çıkarın.
Povidon iyot çözeltisini cilde temiz gazlı bez ve% 70 alkol ile uygulamak için üç alternatif tur kullanarak cildi dezenfekte edin. Daha sonra, eklemlerin proksimal bölgesinde sterilize edilmiş makasla bir ila iki santimetrelik bir kesi yapın ve yağ deposunu ortaya çıkarmak için forseps kullanarak cildi açık tutun. WAT her iki taraftaki cilde tutturulabilir, baştan arkadan ve testislere doğru uzatılabilir.
Forseps kullanarak, enjeksiyonun doğru yerde ve derinlikte olduğundan emin olmak için yağ deposunu insizyondan yavaşça yukarı doğru çekin. Mikrolitre şırıngayı 2.5 mikrolitre adeno ilişkili virüs veya endojen PRDM16 genini hedef alan sgRNA içeren bir AAV ile doldurun. İğneyi IWAT'a 30-45 derecelik bir açıyla dikkatlice yerleştirin.
Tüm IWAT yağ yastığını homojen bir şekilde enfekte etmek için enjeksiyonu dokunun farklı yerlerine beş kez tekrarlayın. Bilinç yeniden kazanılana kadar fareyi ısıtma yastığına yerleştirin. Tamamen iyileşene kadar hayvanı her 10 ila 15 dakikada bir izleyin.
Hayvan bilincini yeniden kazandıktan sonra, doğrusal olması ve sıkıntı veya ağrı belirtisi olmaması gereken lokomotif profillemesini gözlemleyin. Adipo SPH fare IWAT'ından türetilen stromal vasküler hücreleri veya SVF'leri, bir ila iki saat boyunca tam DMEM ortamı içeren 6 Kuyucuklu bir plakaya bakın, ortamı aspire edin, PBS kullanarak kuyuyu iki kez yıkayın ve taze, eksiksiz bir ortamla değiştirin. Hücreler% 70-80 akıcılığa ulaşana kadar hücreleri 37 santigrat derece,% 5 karbondioksit ve% 95 nemde inkübe edin.
0. Günde, hücreleri indüksiyon ortamı ile tedavi ederek farklılaşmayı indükleyin ve iki gün sonra indüksiyon ortamını bakım ortamı ile değiştirin. Yine iki gün sonra, dördüncü günde, bakım ortamını 2-3 gün boyunca taze bir bakım ortamıyla değiştirin. Preadipositler adipositlere tamamen farklılaşana kadar bakım ortamını her 48 saatte bir değiştirin.
Farklılaşmış hücreler lipit damlacıkları ile yüklü gibi göründüğü için ışık mikroskobu kullanarak olgun adipositleri gözlemleyin. Hücreler %70-80 akıcılığa ulaşana kadar hücreleri 6 Kuyucuklu bir kültür plakası üzerinde tam ortamla büyüttükten sonra, AAV taşıyan sgRNA PRDM16'nın mikrolitresi başına 5.6 * 10 ^ 10 viral genomu iki mililitre tam ortam ve hekzadimetrin bromür ile karıştırın. Tam ortamı değiştirerek ve AAV içeren tam ortamı ekleyerek hücreleri dönüştürün.
Dönüştürülen hücreleri 12 saat boyunca 37 santigrat derece,% 95 nem ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Hücreleri bölün ve hücre proliferasyonu ve bej adipositlere farklılaşma için tarif edildiği gibi görün. Adipo SPH farelerinin IWAT'ından alınan immünofloresan görüntüleri, hem kontrol hem de PRDM16 gruplarında dCas9 ekspresyonunu göstermiştir.
SPH'ye bağlı PRDM16 ekspresyonu, çok oküler bej adipositlerin IWAT'a yaygın bir şekilde birikmesine açıkça neden olmuştur. Ayrıca, kantitatif PCR, PRDM16 grubunda PRDM16 ekspresyonunun ve termojenik gen programının kontrole kıyasla arttığını ortaya koydu. Benzer şekilde, in vitro gen ekspresyon analizi, PRDM16 aşırı ekspresyon grubundaki endojen PRDM16 geninin ve termojenik genlerin kontrole kıyasla artmış ekspresyonunu doğruladı.
SPH kaynaklı PRDM16 ekspresyonu, kontrol hücrelerindekinden daha yüksek bazal ve maksimum oksijen tüketimi ile sonuçlandı. Önemli olarak, veriler PRDM16 grubunda, kontrol grubundakine kıyasla bağlanmamış solunumun arttığını göstermiştir. Adipo SPH modeli, adipositler içindeki çoklu genleri ve düzenleyici elementleri araştırmak için uygundur.
Bu yöntem, bej yağ biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılması olasılığını ortaya çıkarır.
