Kombine Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve Adeno İlişkili Virüs Tek Kılavuzlu RNA Sistemi Kullanılarak Kahverengi Yağa Özgü Nakavt Farelerin Üretimi

Bu protokol, bir Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 ve adeno ilişkili virüs tek kılavuzlu RNA sistemi kullanarak kahverengi yağa özgü nakavt fareleri üretir. AAV'yi kahverengi yağa güvenli bir şekilde uygulamak için cerrahi bir teknik içerir. Bu tekniğin temel avantajı, fareleri seçici olarak yetiştirmeye gerek kalmadan dokuya özgü nakavtları hızla üretebilmesidir.

Dokuya özgü nakavt veya nakavt yapma yaklaşımı, AAV enjekte etmek için cerrahi prosedür hedef organa göre değiştirilirse diğer dokulara uyarlanabilir. Başlamak için, postoperatif ağrı ve sıkıntıyı en aza indirmek ve önlemek için anestezi uygulanan UCP1 Cre Cas9 fareye analjezik deri altından uygulayın. Daha sonra kürkü bir tıraş makinesi kullanarak interskapuler bölgesinde tıraş edin ve cerrahi alanı iyot bazlı veya klorheksidin bazlı bir ovmanın en az üç alternatif turu ve ardından% 70 etanol ile sterilize edin.

Bir neşter kullanarak, interskapular yağları açığa çıkarmak için skapula arasındaki kahverengi yağ dokusunun üzerindeki deride iki santimetrelik bir kesi yapın. Tek bir kesi yaptıktan sonra yağ dokularının distal bölgesi ile kaslar arasındaki sınırdaki yağ dokularını kesin. Daha sonra baskın eldeki cerrahi makası kullanarak, kahverengi yağ dokusunu açığa çıkarmak için yağ dokularını künt ve dikey olarak soyun, kahverengi yağ dokusu da dahil olmak üzere yağ dokularını baskın olmayan el ile sıkıştırın.

Sulzer'in damarını, kesin kahverengi yağ dokusu yerini belirtmek için bir dönüm noktası olarak kullanın. Daha sonra, her fare için, 100 mikrolitrelik bir Hamilton şırıngasına bağlı keskin bir 32 gauge iğne kullanarak iki kahverengi yağ dokusunun her bir lobuna yavaşça 20 mikrolitre adeno ilişkili virüs veya AAV enjekte edin. AAV uygulaması sırasında enjekte edilen bölgeden sızıntı olmadığını gösteren başarılı enjeksiyonu onaylayın.

Homeostazı sağladıktan sonra, 5-0 emilebilir bir monofilament iplik kullanarak yağ dokularının ve kasın kenarını dikmek için maruz kalan yağ dokularını normal konumlarına geri yerleştirin. Son olarak, açık cildi 5-0 kaplamalı VICRYL boyasız örgülü ipliklerle dikin. Kahverengi yağ dokusunun kesin yeri, maruz kalmadan tespit edilemez, ancak dokuya aşırı maruz kalma hasarı.

Başarısız enjeksiyonlara yol açabilecek potansiyel kusurlar, AAV çözeltisinin yanlış bölgeye enjekte edilmesini, dokudan iğne penetrasyonunu ve AAV çözeltisinin aşırı hacmi nedeniyle doku balonlaşmasını içeriyordu. AAV tek kılavuz RNA'nın kahverengi yağ dokusuna hassas bir şekilde verilmesi, protokolün başarısı için çok önemliydi. Kahverengi yağ dokusunu açığa çıkarırken başarının anahtarı, makasın yönü ve derinliği ve Hamilton şırıngasının yeri de dahil olmak üzere cerrahi makas tekniğidir.

Bu teknik, kahverengi yağ ile ilgili enerji metabolizmasının moleküler düzenleyicilerini anlamak için yük üreten dokuya özgü nakavt hayvanlarına sahiptir.