Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (NFSC 82101224 to YG) tarafından desteklenmiştir.

Tüm hayvan deneyleri, Xi'an Jiaotong Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı (No. 2021-847).
1. Sterilizasyon ve malzeme hazırlama
<ol><li>Diseksiyon aletlerini yüksek sıcaklık ve yüksek basınçlı buhar dezenfeksiyonu kullanarak sterilize edin ve gece boyunca 50 °C'lik bir inkübatörde kurutun.</li>
	<li>% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 10 mg / mL penisilin / streptomisin içeren 100 mL kültür ortamı hazırlayın (90 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamına (EMEM) 10 mL FBS ve 10 μL penisilin stok çözeltisi ekleyin) önceden ve 4 ° C'de saklayın.</li>
</ol>2. İşitsel epitelin toplanması için temporal kemiğin diseksiyonu ve çıkarılması
<ol><li>Toplam 10 yenidoğan fareyi (P3 ve P5 yaşları arasında) buz üzerinde dekapitasyon ile ötenazi yapın. Gerekirse alternatif, etik olarak onaylanmış bir metodoloji kullanın.</li>
	<li>Başı yerinde tutun, mikro ameliyat makası kullanarak kafa derisini sagital sütür boyunca açın ve Şekil 1A'da gösterildiği gibi kafa derisini parmaklarınızla iki taraflı olarak ayırın ve sabitleyin.</li>
	<li>Küçük bir periosteal asansör kullanarak beyni çıkarın ve bazal kafatasını ikiye bölün. Kafatasını makasla kesin ve kafatasını açmak için öne doğru çevirin; Beyni kazımak ve kafatasının tabanını ortaya çıkarmak için makasın ucunu kullanın.</li>
	<li>Kafatasının tabanındaki bilateral temporal kemikleri gözlemleyin (Şekil 1C). Kafatasının tabanını orta hat boyunca kesmek, deriyi kazımak ve gereksiz kemikleri çıkarmak için makas kullanın (Şekil 1D, D').</li>
	<li>Temporal kemikleri saklayın ve taze Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) içeren 35 mm steril Petri kaplarına aktarın (Şekil 1E).</li>
	<li>Temporal kemiğin petröz kısmından bül ve çevresindeki dokuyu çıkarmak için iki #5 uçlu forseps kullanın (Şekil 1E). NOT: Bu aşamada, farelerin temporal kemiğindeki kemikli labirent tamamen kalsifiye olmayacak ve forseps kullanılarak kolayca diseke edilecektir.</li>
	<li>Temporal kemiğin yarım daire biçimli kısmını sabitlemek için forsepsleri bir elinizle tutun ve kokleanın lateral kemiğini skala girişinden ayırmak için diğer elinizle forsepsin alt ayağını yuvarlak pencere nişine yapıştırın. OC epiteline dokunmadan temporal kemiğin petröz kısmını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, kokleanın kemikli labirentini bazal uçtan apikal uca dikkatlice ayırın ve çıkarın (Şekil 1F).</li>
	<li>#5 uçlu forseps kullanarak Corti duyusal epitel organını modiolustan dikkatlice mikro izole edin (Şekil 1G).</li>
	<li>Spiral ligamenti tutun, mikro çalışma forsepsleri ile stria vaskularisten dikkatlice ayırın ve temiz işitsel epiteli 200 μL'lik bir pipet kullanarak HBSS içeren 3 mm'lik steril bir kültür kabına aktarın (Şekil 1H).</li>
	<li>Her hayvandan 20 örnek toplayın ve bunları bir sonraki hazırlık adımı için HBSS içeren 100 mm'lik steril bir Petri kabına hızlı bir şekilde aktarın (Şekil 1).</li>
</ol>3. İşitsel saç hücreleri elde etmek için enzimatik ayrışma
<ol><li>İşitsel epiteli %0.25 tripsin içeren 10 mL taze DMEM'e aktarın ve 37 °C'de 12 dakika inkübe edin.</li>
	<li>200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, saç hücrelerini bazal laminadan ve diğer hücrelerden ameliyat mikroskobu altında nazikçe ayırın.</li>
	<li>Ayrıştırmayı inhibe etmek için 10 mL daha kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Kültür ortamındaki askıdaki hücreleri 70 μm'lik bir filtreden süzün, süzüntüyü 50 mL'lik temiz bir tüpte toplayın ve 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.</li>
	<li>Saç hücrelerini, 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek en az 5 mL kültür ortamında yeniden süspanse edin. Baloncuk sokmaktan kaçının.</li>
	<li>Altı oyuklu bir plakanın dibine önceden bir lamel yerleştirin. Hücreleri sayın ve altı oyuklu plakalarda 106 hücre / mL yoğunlukta kültürleyin.</li>
	<li>Yapışık hücreleri 37 ° C ve% 5 CO 2'de2 mL DMEM'de (% 10 FBS, 100 birim / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içerir) büyütün. Kültür ortamını her gün değiştirin. NOT: Bu protokolün kullanılmasının saf saç hücrelerinin elde edilmesiyle sonuçlanmadığı belirtilmelidir. Bu birincil hücre kültürü yöntemine dayanarak, saç hücreleri kültürdeki hücrelerin yaklaşık% 70'ini oluşturabileceğinden ve iyi durumda olabileceğinden, daha ileri çalışmalar için d2 veya d3 hücrelerinin kullanılmasını öneririz.</li>
</ol>4. İmmünofloresan boyama
<ol><li>Kültürlenmiş hücreleri d1'den d6'ya kadar hasat edin (günde bir kuyu). Kültür ortamını aspire edin ve hücreleri 2x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.</li>
	<li>Sabitleyiciyi çıkarın ve hücreleri PBS ile 3 x 3 dakika durulayın.</li>
	<li>RT'de 10 dakika boyunca% 0.2 Triton X-100 içeren PBS ile hücreleri geçirgenleştirin.</li>
	<li>Geçirgen hücreleri, RT'de 20 dakika boyunca PBS'de% 10 FBS'den oluşan bir bloke edici çözelti ile inkübe edin.</li>
	<li>Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de anti-miyozin monoklonal antikoru (PBS'de 1:200'de seyreltilmiş) ile boyayın.</li>
	<li>Hücreleri 3x steril PBS ile yıkayın ve ikincil antikor (Alexa Fluor 594 keçi anti-tavşan MYO7A, PBS'de 1:500 seyreltilmiş) ve floresein etiketli falloidin (Alexa Fluor 488, hücre yapısını tanımlamak için) ile 2 saat boyunca inkübe edin.</li>
	<li>İkincil antikorları çıkarmak için hücreleri 3x PBS ile durulayın.</li>
	<li>Slaytların üzerine DAPI ile 1-2 damla montaj ortamı ekleyin, lamelleri monte edin ve hücrelerin fotoğraflarını çekmek için lazer taramalı konfokal mikroskop altına yerleştirin.</li>
</ol>5. İstatistiksel analiz
<ol><li>Miyozin-VIIa ve falloidinin gri değerlerinde zaman içinde meydana gelen değişiklikleri analiz etmek için iki yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'in post hoc testlerini gerçekleştirin. İstatistiksel farklılıkları işaretlemek için harf işaretleme yöntemini kullanın.</li>
	<li>1. günden 6. güne kadar hücre örnekleri arasındaki falloidin pozitif hücre oranını ve aynı günlerde miyozin-VII pozitif hücre oranını karşılaştırmak için ek tek yönlü ANOVA'lar ve ardından Tukey'in post-hoc testleri gerçekleştirin.</li>
</ol>

Fare Koklear Saç Hücrelerinin Etkili In Vitro Yetiştiriciliği

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

HEI-OC1 hücre hattı ile karşılaştırıldığında, saç hücrelerinin birincil kültürleri, hücrelerin fizyolojik durumunu in vivo olarak daha doğru bir şekilde kopyaladı. Bu nedenle, canlı hücrelerin koklear organlardan izole edilmesi ve hemen kültüre edilmesiyle oluşturulan işitsel birincil kültür yöntemi, işitsel sistemler üzerine kapsamlı araştırmalar için değerli bir araç gibi görünmektedir. Başarılı bir kültür için belirli teknikler çok önemlidir. İlk olarak, Corti organının ...

Koklear tüy hücreleri, sesin algılanmasında ve işitme sinirine sinyal iletiminde önemli rol oynar. Saç hücreleri, omurgalılarda birincil duyu reseptörleri olarak işlev gören ve ses titreşimlerini elektrik sinyallerine dönüştüren mekanik hücrelerdir. Memeli iç kulağının duyusal epiteli, tek sıra iç tüy hücresi ve üç sıra dış tüy hücresi içerir. Farklı bazik zar bölgelerinde, tüy hücreleri sesleri farklı frekanslarda (20 ila 2.000 Hz arasında) algılar1. Dış tüy hücrelerinin işlevi, memeli iç kulağına ince ayar yapmaya yardımcı olan ve sese karşı yüksek hassasiyet sağlayan aktif bir mekanik amplifikasyon işlemidir. İç tüy hücreleri sesleri algılamaktan sorumludur. Dereceli depolarizasyondan sonra, akustik bilgi işitsel sinir lifleri yoluyla beyne iletilir2.
İşitme kaybı, dünya çapında önemli bir sağlık sorunu oluşturan genetik kusurlar, yaşlanma, gürültü travması veya ototoksik ilaçların aşırı kullanımından kaynaklanabilir 3,4. İşitme kaybı esas olarak saç hücrelerinde geri dönüşü olmayan hasardan kaynaklanır5. Gürültüye bağlı işitme kaybı ile ilgili olarak, araştırmacılar etiyolojisinin çeşitli ayrıntıları üzerinde fikir birliğine varmış olsalar da, altta yatan çok sayıda mekanizmanın kapsamlı bir şekilde anlaşılması eksiktir. Dış tüy hücreleri, akustik aşırı maruz kalmaya karşı özellikle savunmasızdır6. Mekanosensitif koklear tüy hücreleri yaşa bağlı işitme kaybında rol oynar; Bununla birlikte, saç hücresi dejenerasyonunun altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar bilinmemektedir. Moleküler süreçlerdeki çeşitli değişiklikler, saç hücresi yaşlanmasına, oksidatif strese, DNA hasar tepkisine, otofajiye ve saç hücresi uzmanlığı ile ilgili genlerin ekspresyonunun ve transkripsiyonunun düzensizliğine yol açar7.
İç kulak, vücudun en sert kemiğinin derinliklerinde, temporal kemikle kaplı olduğundan, deneysel olarak erişilemez ve tüylü hücre onarımı ve rejenerasyonu mekanizmalarına ilişkin araştırmalara meydan okur. Bu nedenle, saç hücrelerinin işlevini araştırmak için in vitro kültürlerin oluşturulması, iç kulağın yenilenme ve yaralanma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir yöntem haline gelmiştir. Koklear organotipik kültürlerin hazırlanmasına yönelik prosedürler daha önceki çalışmalardatanımlanmıştır 8,9,10. Dünya çapındaki araştırmacılar çeşitli koklear mikrodiseksiyon ve yüzey hazırlama teknikleri kullanmışlardır. Kalıcı zorluklara rağmen, çeşitli birincil saç hücresi kültürü sistemleri in vitro olarak başarıyla kurulmuştur. Koklear organ kültürleri, tüy hücreleri, Deiter hücreleri, Hensen hücreleri, sütun hücreleri ve işitsel sinir lifleri dahil olmak üzere çeşitli hücre tipleri içerir. Yaralanma sonrası hücresel ve moleküler seviyelerde saç hücrelerindeki değişikliklerin derinlemesine anlaşılması, daha güçlü araştırma araçlarının geliştirilmesini sağlayacaktır. Bu çalışma, in vitro çalışmalar için yenidoğan farelerden koklear organları izole etme ve bol miktarda tüy hücrelerini enzimatik olarak ayırma adımlarını göstermeyi amaçladı. Kültürlenen hücrelerin doğası, immünofloresan boyama kullanılarak doğrulandı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

Koklear tüy hücreleri, işitsel sistemin duyusal reseptörleridir. Bu hücreler, iç kulağın kemik labirenti içinde, işitmeden sorumlu duyu organı olan Corti'nin organında bulunur. Koklear saç hücreleri, anatomik ve fonksiyonel olarak farklı iki tipten oluşur: dış ve iç tüy hücreleri. Bunlardan herhangi birinin hasar görmesi işitme kaybına neden olur. Özellikle, iç saç hücreleri yenilenemediğinden ve onlara verilen hasar kalıcıdır. Bu nedenle, birincil saç hücrelerinin in vitro olarak yetiştirilmesi, koklear saç hücrelerinin koruyucu veya yenileyici etkilerini araştırmak için vazgeçilmezdir. Bu çalışma, fare kılı hücrelerini izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem keşfetmeyi amaçladı. 
Koklear lateral duvarın manuel olarak çıkarılmasından sonra, işitsel epitel koklear modiolden mikroskop altında titizlikle diseke edildi, 37 °C'de 10 dakika boyunca %0.25 tripsin-EDTA'dan oluşan bir karışım içinde inkübe edildi ve 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılarak kültür ortamında hafifçe süspanse edildi. Hücre süspansiyonu bir hücre filtresinden geçirildi, süzüntü santrifüj edildi ve hücreler 24 oyuklu plakalarda kültürlendi. Saç hücreleri, motor gerilimlerde yer alan bir mekanotransdüksiyon kompleksi olan miyozin-VIIa'yı eksprese etme kapasitelerine ve falloidin kullanılarak F-aktinin seçici etiketlenmesine dayalı olarak tanımlandı. Hücreler kültürde 4 gün sonra% >90 birleşmeye ulaştı. Bu yöntem, in vitro kültürlenmiş saç hücrelerinin biyolojik özellikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir ve koklear saç hücresi kültürlerinin etkinliğini göstererek daha ileri işitsel araştırmalar için sağlam bir metodolojik temel oluşturabilir.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

Yazar Spotlight: İşitsel Araştırmalar için Fare Saç Hücrelerinin Yetiştirilmesindeki Gelişmeler 

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Bu protokolü takiben, izole edilmiş hücreleri tohumladık. Birincil koklear tüy hücresi tohumları, hücreler kültür ortamında yüzmezse ve 24 saat içinde yayılmazsa başarılı kabul edildi. Saç hücrelerinin yapıştıktan ve çanağın dibinde düz agregalara yayıldıktan sonra sayısını belirledik. 1 gün sonra canlı saç hücreleri kültür kabının dibine sıkıca yapıştırıldı ve yapışmayan hücreler PBS ile durulanarak uzaklaştırıldı. Tipik olarak, hücre sayısı 3 günlük kültürden ...

Watch this Scientific Journal Video about Advancements in Cultivating Mouse Hair Cells for Auditory Research at JoVE.com

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

İç kulak, temporal kemikle kaplıdır, vücudun en sert kemiğinin derinliklerindedir ve araştırmaları zorlaştırır. Birincil saç hücrelerinin yetiştirilmesi, koklear saç hücrelerinin araştırılması için vazgeçilmezdir. Bu çalışma, fare kılı hücrelerini izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem keşfetmeyi amaçladı.İn vitro çalışmalar için koklear organları doğal farelerinizden izole etme ve bol miktarda tüy hücresini asimetrik olarak ayırma adımlarını gösteriyoruz. Kültürlenen hücrelerin doğası, immünofloresan boyama kullanılarak doğrulandı. Koklear organlardan canlı hücrelerin izole edilmesiyle oluşturulan üç ana kültür yöntemi vardır ve bu hücrelere hemen koçluk yapmak, kapsamlı araştırmalar için değerli bir araç olarak eşleştirilir, her üç sistemdir.Bu yöntem, in-vivo kültürlenmiş saç hücrelerinin biyolojik özellikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirebilir ve koklear saç hücresi kültürlerinin etkinliğini göstererek daha ileri işitsel araştırmalar için sağlam bir metodolojik temel oluşturabilir.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K Görüntüleme.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. İç kulak, temporal kemikle kaplıdır, vücudun en sert kemiğinin derinliklerindedir ve araştırmaları zorlaştırır. Birincil saç hücrelerinin yetiştirilmesi, koklear saç hücrelerinin araştırılması için vazgeçilmezdir. Bu çalışma, fare kılı hücrelerini izole etmek ve yetiştirmek için bir yöntem keşfetmeyi amaçladı.İn vitro çalışmalar için koklear organları doğal farelerinizden izole etme ve bol miktarda tüy hücresini asimetrik olarak ayırma adım...

Video: Yazar Spotlight: İşitsel Araştırmalar için Fare Saç Hücrelerinin Yetiştirilmesindeki Gelişmeler 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Biyoloji

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

Yenidoğan Farelerden İşitsel Epitel Toplamak için Temporal Kemiğin Diseksiyonu ve Çıkarılması

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.