WSU Küçük Hayvan İç Hastalıkları servisine (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) ve WSU VTH Klinik Çalışmalar Koordinatörü Valorie Wiss'e vaka alımı ve vatandaş bilim adamlarından (hasta bağışçıları) numune toplama konusundaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Direktörlük Ofisi, Ulusal Sağlık Enstitüleri (K01OD030515 ve Y.M.A.'ya R21OD031903) ve Japonya Genç Araştırmacılar için Denizaşırı Bilim Mücadele Programını Teşvik Derneği (202280196'den I.N.'ye) tarafından desteklenmiştir. Şekil 1A ve Şekil 3A , BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Bir Köpek IBD Çip Üzerinde Bağırsak Sisteminde 3D Morfogenezin Kurulması

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu çalışma, köpek bağırsak organoidlerinin bir köpek IBD Çip Üzerinde Bağırsak modelinin geliştirilmesiyle uyumluluğunun öncü gösterimini işaret etmektedir. Bağırsak organoidlerinin ve organoid türevli tek tabakalı kültürlerin bir mikroakışkan sisteme (yani, Çip Üzerinde Bağırsak sistemi) entegrasyonu, fizyolojik dinamikleri yakından taklit eden ve biyolojik koşulları daha iyi temsil eden in vitro bağırsak modellerinin oluşturulmasını sağlayan teknolojiyi daha da geliştirmiştir. Özellikle, insanlarda IBD'den türetilmiş organoidleri kullanan Çip Üzerinde Bağırsak kültürüne ilişkin çok az rapor bulunduğundan, köpek IBD'sinden türetilen Çip Üzerinde Bağırsak kullanan mevcut çalışma, insanlarda IBD çalışmasına ilişkin öncü bilgiler sağlayabilir.
Bir Çip Üzerinde Bağırsak üzerinde köpek bağırsak epitelyal 3D morfogenezinin başarılı bir şekilde geliştirilmesi, birkaç kritik adıma dikkat edilmesini gerektirir. İlk olarak, PDMS mikroakışkan kanallarının hidrofobik yüzeyi, ECM adezyonunu ve müteakip hücre bağlanmasını engelleyebilir, bu da ECM kaplaması ve hücre tohumlamasından önce PDMS'nin yüzey aktivasyonunu gerektirebilir (bkz. protokol bölüm 1). Stabil bir tek tabakalı kültür elde etmek için, hücre bağlanmasını takiben fazla bağlanmamış hücrelerin çıkarılması çok önemlidir (protokol adımları 4.6-4.7). Ek olarak, bağırsak epitelinin 3D morfogenezi için sabit ortam akışı ve peristaltik benzeri vakum hareketi gibi dinamik stimülasyon gereklidir (protokol adımı 5.2). Gut-on-a-Chip kültürünün herhangi bir adımında mikrokanaldaki hava kabarcıklarını önlemek için dikkatli kullanım şarttır.
Çip Üzerinde Bağırsak'a zayıf hücre tohumlaması ile karşılaşırsanız, bunun nedeni düşük hücre sayısı veya zayıf hücre bağlantısı olabilir. Düşük hücre sayılarını gidermek için, Matrigel'deki büyümelerini gözlemleyerek hazırlanmış bağırsak organoidlerinin sağlığını incelemek önemlidir. Hücre canlılığı, hücrelerin %20'sinden fazlasının ölmediğinden emin olmak için hücre ayrışmasından sonra Tripan mavisi boyama ile değerlendirilebilir. Canlı hücre sayıları yetersizse, organoid ortam koşullarının optimize edilmesi denenebilir. Diğer bir olasılık, eksik organoid ayrışmadır, bu da filtre tarafından sıkışan 70 μm'den daha büyük hücre kümelerinin fazlalığına neden olur. Bu sorunu çözmek için seçeneklerden biri, hücre ayrışması sırasında pipetleme süresini uzatmaktır. Alternatif olarak, 15 mL'lik konik tüp, tripsin benzeri bir proteaz ile tedavi edilirken her dakika hafifçe çalkalanabilir. Gut-on-a-Chip'e zayıf hücre bağlanması, uygun olmayan ECM kaplamasından kaynaklanıyor olabilir. Kaplama işlemi sırasında, hava kabarcıklarının varlığının dikkatlice kontrol edilmesi ve gerektiğinde nazikçe daha fazla kaplama çözeltisi eklenerek oluşumlarının önlenmesi tavsiye edilir. Hücrelerin aşırı kalabalıklaşması ve bağlanmamış hücrelerin yıkanamaması, yetersiz bir başlangıç tek katmanına neden olabilir. Böyle bir durumda, şırınga pistonunu iterken hafif bir darbe uygulanabilir. Bu sorun giderme adımları, Gut-on-a-Chip kültürü işlemi sırasındaki sorunları tanımlamaya ve gidermeye yardımcı olabilir.
Bu Çip Üzerinde Bağırsak platformu, dalgalı 3D epitel katmanlarının oluşturulmasını sağlarken, bağırsak mikro ortamını tam olarak çoğaltmak için ek biyolojik karmaşıklığa ihtiyaç duyulduğunun farkındayız. Epitelyal ve mezenkimal hücreler arasındaki etkileşimleri, 3D rejenerasyon için ECM birikimini ve uygun bir kök hücre nişi oluşturan kript-villus özelliklerinin varlığını dikkate almak çok önemlidir. Fibroblastlar gibi stromal hücreler, ECM proteinlerinin üretiminde ve bağırsak morfogenezinin düzenlenmesinde hayati bir rol oynar34,35,36. Mezenkimal hücrelerin bu modele dahil edilmesi, hem morfogenezi hem de hücre bağlanmasının verimliliğini artırma potansiyeline sahiptir. Kılcal damar sistemini ve lenfatik damarları kapsayan endotel tabakaları, moleküler taşımayı ve bağışıklık hücrelerinin işe alımını yönetmede çok önemli bir rol oynar37,38. Hasta kaynaklı bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasındaki etkileşimin gösterilmesine ve dokuya özgü bağışıklığın kurulmasına izin verdiği için bağırsak hastalıklarının modellenmesinde gerekli olabilir39. Gut-on-a-Chip'te 3D morfogenezin tamamlanmasının ardından, organoid kültür ortamı bir organoid farklılaşma ortamına değiştirilebilir. Bu, deneysel hedeflere bağlı olarak ek hücresel farklılaşmayı indüklemek için uygun bir yaklaşım olabilir.
3D mikro mimariyi yerinde görüntülemek, uzun mesafeli bir hedefle üstesinden gelinebilecek uzun çalışma mesafesi nedeniyle zordur. Ek olarak, katman katman mikrofabrikasyon ve yapıştırma yöntemleri, SEM ile inceleme için üst katmanlara erişimi zorlaştırmaktadır. Mevcut Gut-on-a-Chip tasarımı için, Gut-on-a-Chip mikro cihazı başına bir şırınga pompasına ihtiyaç vardır, bu da CO2 inkübatör alanını kaplar ve büyük ölçekli deneyleri önler. Kullanıcı dostu bir platform ve yüksek verimli tarama için ölçeklenebilirliği artırmak için yeniliklere ihtiyaç vardır.
Bu mevcut protokoller, geleneksel 3D organoidlerin, 2D tek tabakaların ve statik mikrocihaz kültür sistemlerinin sınırlamalarını aşarak, in vitro olarak 3D epitel katmanlarının kendiliğinden gelişmesine izin verir. Bu dinamik in vitro bağırsak mikroçevresi, çeşitli hücre tiplerinin ko-kültürü eklenerek kontrol edilebilir. Önceki çalışmalar, bağırsak mikrobiyomunun14,23 ve periferik mononükleer hücrelerin30 birlikte kültürlenmesi de dahil olmak üzere Çip Üzerinde Bağırsak mikro ortamını manipüle etme yöntemlerini araştırmıştır. Bu yeniden yapılandırılmış mikro çevre, ilaç testi, temel mekanik çalışmalar ve hastalık modellemesi dahil olmak üzere çok sayıda potansiyel uygulamaya sahiptir. Yeniden yapılandırılmış mikro çevre, ilaç testi 23,40,41 ve hastalık modellemesi 12,13,14,30 gibi çok çeşitli uygulamalar için önemli bir potansiyele sahiptir ve ayrıca bağırsak morfogenezinin temel mekanik araştırmaları 42. Metabolitlerin değerlendirilmesi için süpernatanlar toplanarak 43, genomik inceleme için hücreler toplanarak 2,32 veya canlı hücre boyaları kullanılarak hücrelerin görsel olarak incelenmesi veya sonraki immünofloresan görüntülemeiçin fiksasyon23,44 ile çeşitli testler yapılabilir.
Bu çalışma, bir Gut-on-a-Chip platformunda köpek bağırsak epitel katmanlarının 3D morfogenezini geliştirmek için tekrarlanabilir bir protokol sunmaktadır. Ortaya çıkan 3D epitel yapısı, çeşitli biyomedikal çalışmalarda uygulamalar için muazzam bir potansiyele sahip olan bağırsak mikro ortamının daha gerçekçi bir temsilini sağlar. Bu bağırsak mimarisini kullanarak, daha fazla translasyonel araştırma yapabilir ve potansiyel olarak umut verici sonuçlar verebiliriz.

Bağırsak epitelyal morfogenezi büyük ölçüde maliyetli, zaman alıcı ve insan gelişim süreçlerini doğru bir şekilde temsil etmeyen laboratuvar hayvanı modelleri aracılığıyla incelenmiştir1. Ayrıca, geleneksel statik 2D hücre kültürü modelleri, bir 3D epitel mimarisinin karmaşık uzamsal organizasyonunu taklit etme yeteneğinden yoksundur2. Sonuç olarak, bağırsak epitel mimarisi anlayışımızı ilerletmek için insanla ilgili hayvan modellerinden bağırsak epitel hücrelerini kullanarak in vitro 3D morfogenezi indüklemek için bir protokole ihtiyaç vardır.
Refakatçi köpekler, evcilleştirme sırasında ortak ortamları ve diyetleri nedeniyle insanlara oldukça benzeyen bağırsak anatomisi ve mikrobiyom bileşimleri geliştirmiştir3. Bu benzerliğe ek olarak, hem insanlar hem de köpekler, bağırsak sağlığına atfedildiği düşünülen çeşitli kronik morbiditeleri paylaşırlar. Köpekler, insanlar gibi, obezite, bilişsel işlev bozukluğu, diabetes mellitus, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) ve kolorektal adenokarsinom 4,5,6,7,8,9,10 gibi kronik durumlar geliştirebilir. Önceki Gut-on-a-Chip çalışmalarında insan ve fare epitel hücrelerinin geliştirilmesine ve kullanılmasına rağmen 2,11,12,13,14, köpek bağırsak epiteli şimdiye kadar kullanılmamıştır. 3D epitelyal morfogeneze sahip dinamik bir kültür sisteminde köpek bağırsak organoid epitelini kullanan yeni yaklaşımımız, hem köpek hem de insan tıbbı için önemli etkilere sahiptir.
Bağırsak organoid kültüründeki son gelişmeler, köpek bağırsak organoid kültürünün kurulmasına yol açmıştır15. Bu kültür sistemi, tanımlanmış morfojen koşullandırma altında bağırsak kök hücrelerinin kültürlenmesini içerir ve yetişkin kök hücrelerden türetilen kendi kendini yenileme özelliklerine sahip bir 3D modelile sonuçlanır 16. Bununla birlikte, taşıma tahlilleri veya konakçı-mikrobiyom kokültürlerinin yürütülmesi, bağırsak lümeninin kapalı doğası nedeniyle bu 3D modelle zorluklar ortaya çıkarmaktadır17. Bunu ele almak için araştırmacılar, bağırsak organoidlerinden türetilen ve luminal yüzeyin18,19 açığa çıkmasına izin veren bir 2D tek tabaka oluşturdular. Bununla birlikte, hem 3D organoidler hem de 2D tek tabakalar, bağırsak mikroçevresinin in vivo biyomekaniğini doğru bir şekilde yansıtmayan statik koşullar altında tutulur. Hasta kaynaklı köpek organoidleri teknolojisinin in vitro 3D morfogenez ile birleştirilmesi, kronik multifaktöriyel hastalıklara yönelik translasyonel araştırmalar için bir fırsat sunar. Bu yaklaşım, araştırmacıların hem insanlara hem de köpeklere fayda sağlayan daha etkili tedaviler geliştirmelerine ve insan, hayvan ve çevre sağlığının birbirine bağlılığını tanıyan işbirlikçi bir yaklaşım olan Tek Sağlık Girişimi ile uyumlu olarak çeviri araştırmalarını daha da ilerletmelerine olanak tanır. Karmaşık sağlık sorunlarını ele almak ve herkes için en iyi sağlık sonuçlarını elde etmek için disiplinler arası işbirliğini teşvik eder. Girişim, insanlar, hayvanlar ve ekosistemler arasındaki karşılıklı bağımlılıkları anlayarak, ortaya çıkan bulaşıcı hastalıklardan, çevresel bozulmadan ve diğer ortak sağlık sorunlarından kaynaklanan riskleri azaltmayı amaçlamaktadır20,21,22.
Bu protokol, polidimetilsiloksan (PDMS) bazlı gözenekli membrana sahip bir Gut-on-a-Chip mikro cihazında hasta organoidlerinden elde edilen köpek bağırsak epitel hücrelerinin kültürlenmesi için kapsamlı yöntemleri özetlemektedir. Köpek bağırsak organoidlerini ve bu Gut-on-a-Chip teknolojisini entegre ederek 3D epitelyal morfogenezin oluşturulması, bağırsağın hücresel organizasyonunu ve kök hücre nişini nasıl geliştirdiğini ve koruduğunu incelememizi sağlar. Bu platform, mikrobiyom topluluklarının bağırsak sağlığı üzerindeki etkisini araştırmak ve bu toplulukların bağırsak patofizyolojisine katkıda bulunan mikrobiyal metabolitleri nasıl ürettiğini anlamak için değerli bir fırsat sunmaktadır14,23. Bu gelişmeler artık köpek bağırsak örneklerine genişletilebilir ve araştırmacılara bağırsak mikrobiyomu ile konakçı fizyolojisi arasındaki karmaşık ilişkiyi keşfetme fırsatları sunar. Bu, bağırsak patofizyolojisinin altında yatan mekanizmalar hakkında değerli bilgiler edinmek ve mikrobiyal metabolitlerin hem köpek hem de insan sağlığında ve ayrıca çeşitli hastalık durumlarında potansiyel rolünü anlamak için yollar açar. Köpek Gut-on-a-Chip için kullanılan protokol tekrarlanabilir, bu da onu karşılaştırmalı tıp için uygun bir deneysel model haline getirir, çünkü bu yaklaşım hem köpeklerde hem de insanlarda konak-mikrobiyom etkileşimlerinin, patojen enfeksiyonlarının ve probiyotik bazlı terapötik etkilerin araştırılmasını sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Organoid basal medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>2 mM, glutamine substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M HEPES</td>
			<td>VWR Life Science</td>
			<td>J848-500ML</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin&#8211;streptomycin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>MT30009CI</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organoids and organoid medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A-83-01&#160;</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>9094360</td>
			<td>500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Reprocell</td>
			<td>04-0004-base</td>
			<td>2.5 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293 cells engineered to secrete Noggin&#160;</td>
			<td>Baylor College of Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Wnt-3a</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>315-20-10UG</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165-25G</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 MAX Media supplement&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>1x&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>10% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>100 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin1 (Rspo1) cells</td>
			<td>Trevigen</td>
			<td>3710-001-01</td>
			<td>Rspo1 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondin-1 Conditioned Medium</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>20% vol/vol&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-25MG</td>
			<td>&#160;10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>StemCellTechnologies</td>
			<td>72308</td>
			<td>10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[Leu15 ]-Gastrin I human&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.5MG</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ19943K2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A22287</td>
			<td>x250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Rabbit IgG H&#38;L labeled with Alexa Fluor 555</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 polyclonal antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>x50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10483-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>62248</td>
			<td>x1,000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMS Glutaraldehyde Aqueous 50%</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel Matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356255</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethyleneimine) solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>408700-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>87V Industrial Multimeter</td>
			<td>Fluke Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5910R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>C170i</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMi8 fluorescence microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry oven</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-103-0519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlexCell FX-5000 Tension system</td>
			<td>Flexcell International Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted phase-contrast microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>DMi1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X inverted confocal microscope</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td>SP8-X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>model no. BS-8000 120V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, 3 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 1 mL sterile</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>14-823-434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/ozone generator</td>
			<td>Jelight Company</td>
			<td>model no. 30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X imaging software&#160;</td>
			<td>Leica microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional morphogenesis in canine gut-on-a-chip using intestinal organoids derived from inflammatory bowel disease patients

Köpek bağırsakları anatomi, mikrobiyoloji ve fizyoloji açısından insanlarınkiyle benzerliklere sahiptir ve köpekler doğal olarak insanlara benzer kendiliğinden bağırsak bozuklukları geliştirir. Bağırsak epitelinin apikal yüzeyine erişimde üç boyutlu (3D) organoidlerin doğal sınırlamasının üstesinden gelmek, organoidlerden türetilen hücreleri kullanarak erişilebilir luminal yüzeyi ortaya çıkaran iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültürlerin üretilmesine yol açmıştır. Bu organoidlerin ve organoid türevli tek tabakalı kültürlerin mikroakışkan bir Çip Üzerinde Bağırsak sistemine entegrasyonu, teknolojiyi daha da geliştirerek, fizyolojik olarak daha ilgili dinamik in vitro bağırsak modellerinin geliştirilmesine izin verdi.
Bu çalışmada, inflamatuar bağırsak hastalığından (IBD) etkilenen köpeklerden elde edilen primer bağırsak dokusu örneklerini kullanarak köpek bağırsak epitelinin 3D morfogenezini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 3D bağırsak organoidlerinden türetilen hücreleri kullanarak 2D tek katmanlı kültürler ve çip üzerinde bağırsak sistemleri oluşturmak ve sürdürmek için bir protokol özetliyoruz. Bu çalışmada sunulan protokoller, köpekler için özel olarak tasarlanmış mikroakışkan bir Çip Üzerinde Bağırsak sistemi oluşturmak için temel bir çerçeve görevi görür. Bu yenilikçi yaklaşımın temelini atarak, Tek Sağlık Girişimi ilkeleriyle uyumlu olarak bu tekniklerin biyomedikal ve translasyonel araştırmalarda uygulanmasını genişletmeyi amaçlıyoruz. Bu yaklaşımı kullanarak, hem köpeklerde hem de insanlarda bağırsak fizyolojisini incelemek için fizyolojik olarak daha ilgili dinamik in vitro modeller geliştirebiliriz. Bu, her iki türde de bağırsak hastalıkları için daha etkili tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olabileceğinden, biyomedikal ve farmasötik uygulamalar için önemli etkilere sahiptir.

Intestinal epithelial morphogenesis has been largely studied through laboratory animal models, which are costly, time-consuming, and do not accurately represent human developmental processes1. Furthermore, conventional static 2D cell culture models lack the ability to mimic the complex spatial organization of a 3D epithelial architecture2. As a result, there is a need for a protocol to induce in vitro 3D morphogenesis using intestinal epithelial cells from human-relevant animal models to advance our understanding of gut epithelial architecture.
Companion dogs have developed intestinal anatomy and microbiome compositions that are remarkably similar to humans due to their shared environment and diet during domestication3. In addition to this similarity, both humans and dogs share various chronic morbidities that are thought to be attributed to intestinal health. Dogs, like humans, can spontaneously develop chronic conditions such as obesity, cognitive dysfunction, diabetes mellitus, inflammatory bowel disease (IBD), and colorectal adenocarcinoma4,5,6,7,8,9,10. Despite the development and use of human and murine epithelial cells in previous Gut-on-a-Chip studies2,11,12,13,14, canine intestinal epithelium has not been utilized until now. Our novel approach, utilizing canine intestinal organoid epithelium in a dynamic culture system with a 3D epithelial morphogenesis, has significant implications for both canine and human medicine.
Recent advancements in intestinal organoid culture have led to the establishment of canine intestinal organoid culture15. This culture system involves culturing intestinal stem cells under defined morphogen conditioning, resulting in a 3D model with self-renewing properties derived from adult stem cells16. However, conducting transport assays or host-microbiome cocultures poses difficulties with this 3D model because of the enclosed nature of the intestinal lumen17. To address this, researchers have generated a 2D monolayer derived from intestinal organoids, allowing for exposure of the luminal surface18,19. However, both 3D organoids and 2D monolayers are maintained under static conditions, which do not accurately reflect the in vivo biomechanics of the intestinal microenvironment. Combining patient-derived canine organoids technology with in vitro 3D morphogenesis presents an opportunity for translational research into chronic multifactorial diseases. This approach enables researchers to develop more effective treatments benefiting both humans and dogs and further advance translational research, aligning with the One Health Initiative, which is a collaborative approach that recognizes the interconnectedness of human, animal, and environmental health. It promotes interdisciplinary cooperation to address complex health challenges and achieve optimal health outcomes for all. By understanding the interdependencies between humans, animals, and ecosystems, the initiative aims to mitigate risks from emerging infectious diseases, environmental degradation, and other shared health concerns20,21,22.
This protocol outlines comprehensive methods for culturing canine intestinal epithelial cells obtained from patient organoids on a Gut-on-a-Chip microdevice with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based porous membrane. Establishing the 3D epithelial morphogenesis by integrating canine intestinal organoids and this Gut-on-a-Chip technology enables us to study how the gut develops and maintains its cellular organization and stem cell niche. This platform offers a valuable opportunity to investigate the impact of microbiome communities on gut health and understand how these communities generate microbial metabolites that contribute to intestinal pathophysiology14,23. These advancements can now be extended to canine intestinal samples, providing researchers with opportunities to explore the intricate relationship between the gut microbiome and host physiology. This opens up avenues for gaining valuable insights into the underlying mechanisms of intestinal pathophysiology and understanding the potential role of microbial metabolites in both canine and human health, as well as various disease conditions. The protocol used for canine Gut-on-a-Chip is reproducible, making it a suitable experimental model for comparative medicine, as this approach enables investigation of host-microbiome interactions, pathogen infections, and probiotic-based therapeutic effects in both dogs and humans.

Yazar Spotlight: 3D Bağırsak Morfogenez Çalışmaları için Köpek IBD Çip Üzerinde Bağırsak Modelinin Geliştirilmesi ve Uygulanması 

İnflamatuar Bağırsak Hastalığı Hastalarından Türetilen Bağırsak Organoidleri Kullanılarak Çip Üzerinde Köpek Bağırsağında Üç Boyutlu Morfogenez

Bu protokol, bir Çip Üzerinde Bağırsak sisteminde 3D bağırsak morfogenezinin spontan gelişimini güvenilir bir şekilde kolaylaştırır. Bu yaklaşım, inflamatuar bağırsak hastalığından (IBD) etkilenen köpeklerden elde edilen bağırsak organoidlerinden elde edilen köpek bağırsak epitel hücrelerini kullanır (Şekil 1B). Köpek bağırsak epitel hücrelerinin 3D morfogenezinin ara sıra kümelenmesi, 6-9 günlük orta akışı takiben mikrokanal boyunca gözlenebilir (Şekil 3C). Bu morfolojik değişiklikler faz kontrast teknikleri kullanılarak izlenebilir. Bu çalışmada, İBH tanısı konan iki köpekten elde edilen organoidler kullanıldı. Özellikle, her biri iki teknik kopya ile gerçekleştirilen iki biyolojik kopyada başarılı 3D morfogenez gözlendi. Bu çalışmadan elde edilen bulgular, diğer köpek donörlerinden elde edilen bağırsak organoidlerini içeren gelecekteki araştırmalar için bir temel oluşturmaktadır. Bu sonuçlar, daha önce insan örneklerinde rapor edilmiş olan deneysel yaklaşımımızın potansiyel uygulanabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Bu bulgular, Çip Üzerinde Bağırsak teknolojisinin, insan bağırsak epitel hücrelerini kullanan çalışmalarda daha önce bildirildiği gibi köpek bağırsak epitel hücrelerine uygulanabilir olduğuna dair daha fazla doğrulama sağlar2.
Bu protokol, immünofloresan boyamanın, geleneksel floresan mikroskobu kullanılarak mikroakışkan çiplerde villus benzeri yapılar oluşturan organoid türevli tek tabakaların 3 boyutlu yapısını değerlendirmek için kullanılabileceğini göstermiştir (Şekil 4 A,B). Bu protokol, immünofloresan boyama yoluyla farklılaşmış ve uzamsal olarak organize edilmiş hücresel fenotipleri doğrulamak için uyarlanabilir. Bir Çip üzerinde Bağırsak içindeki bir 3D morfogenezin görselleştirilmesi, çeşitli patolojik etkileşimler sırasında konakçı yanıtını araştırmak için mükemmel bir fırsat sağlar 14,23,31. Daha önce insanlarda tarif edildiği gibi, hasta donörlerinden elde edilen epitel hücreleri ile birleştirildiğinde, bu teknoloji bağırsak hastalıklarının kişiselleştirilmiş modellerini oluşturmak için kullanılabilir13. İmmünofloresan görüntülemenin floresan in situ hibridizasyon gibi hedeflenen RNA görselleştirme teknikleriyle entegrasyonu sayesinde, bir Gut-on-a-Chip sistemi içinde konakçının transkriptomlarını ve proteomlarını görsel olarak analiz etmek mümkün olabilir.
Bağırsak zarının bütünlüğünün korunması, bağırsak homeostazının sürdürülmesi için hayati önem taşır ve Gut-on-a-Chip platformu, bu önemli işlevin hassas bir şekilde izlenmesine ve ölçülmesine izin vererek değerli bir avantaj sağlar. Gut-on-a-Chip teknolojisi kullanılarak TEER ölçümü çeşitli avantajlar sunar. Örneğin, önceki çalışmalar, bağırsak hücrelerini patojenik olmayan ve probiyotik bakterilerle birlikte kültürlerken TEER'i başarılı bir şekilde değerlendirmiştir32 ve ayrıca sızdıran bağırsak koşullarıaltında 23. Bu, araştırmacıların farklı koşulların bağırsak bariyer fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemelerine ve bağırsak sağlığını geliştirmek için potansiyel müdahaleleri belirlemelerine olanak tanır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig01.jpg"> Şekil 1: Hasta kaynaklı köpek IBD Gut-on-a-Chip'in kurulması. (A) Hastadan türetilen bağırsak organoidlerinin ve Gut-on-a-Chip platformunun entegrasyonu. Donöre özgü bağırsak organoidleri geliştirmek için bağırsak kript hücrelerini izole etmek için endoskopi biyopsisi yapılabilir. Epitel hücreleri, organoidlerden tek hücrelere ayrılabilir, daha sonra PDMS tabanlı bir Çip Üzerinde Gut-on-A-Chip'e tohumlanabilir ve benzersiz bir dinamik mikro ortamda kültürlenebilir. (B) Bir IBD köpeğinden alınan kolonoidlerin temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) Bu şema, üst ve alt mikro kanallar arasına yerleştirilmiş gözenekli bir zardan oluşan bir Çip Üzerinde Bağırsak cihazını göstermektedir. Üst mikro kanal mavi alanla, alt mikro kanal ise kırmızı alanla gösterilir. Mikrokanalın her iki tarafında, peristaltik hareketi taklit etmek için gözenekli zarı deforme edenvakum odaları bulunur 24. (D) Bir köpek Çip Üzerinde Bağırsak kurulumu, bir kapak fişi 2,24 üzerine yerleştirilmiş boru ile monte edilmiş PDMS tabanlı bir Çip Üzerinde Bağırsak içerir. Baypas hortumu, taşıma sırasında (yani şırıngalara bağlanma) mikrokanal içinde basınç oluşmasını önlemek için kritik öneme sahiptir. Boruyu sıkıştırmak için bağlayıcı klipsler kullanılır. Hacme duyarlı malzemeler, üst veya alt çıkışın açık deliklerinden infüze edilebilir. Organoid kültür ortamı, şırıngaların kör uçlu iğnelere ve üst ve alt girişten akışa bağlanmasıyla infüze edilebilir. Kısaltmalar: IBD = inflamatuar bağırsak hastalığı; PDMS = polidimetilsiloksan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig02.jpg"> Şekil 2: Köpek IBD Gut-on-a-Chip'te villus benzeri yapıların oluşumu. Ayrışmış epitel hücreleri, ECM kaplı bir Çip Üzerinde Gut-on-A-Chip'e ekildi. Ayrışan hücreler PDMS membranına bağlandıktan sonra 3 gün boyunca apikal akış başlatıldı (D0-D3). Birleşen bir 2D tek tabaka oluştuğunda (D3), sık esneme ile bazolateral akış başlatılır (Germe, AP ve BL Akışı). 2-3 günlük ikili akış ve membran gerilmesinden sonra, 2D tek tabaka 3D morfogenez geliştirmeye başlar ve 9 günlük kültürden sonra villus benzeri yapılar oluşur (3D morfogenez, D9-D12). Kısaltmalar: ECM = hücre dışı matris; PDMS = polidimetilsiloksan; AP = apikal; BL = bazolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig03.jpg"> Şekil 3: Çip üzerinde Bağırsakta köpek bağırsak organoid tohumlaması ve 3D morfogenez . (A) PDMS tabanlı bir Gut-on-a-Chip'te gözenekli bir zarın yüzey aktivasyonu için deneysel adımlar. UV/Ozon tedavisi, PEI ve GA işleminin birlikte kullanılması, ECM çözeltilerinde bulunan aminlerin çapraz bağlanmasını kolaylaştırır. Bu işlem, ECM proteinlerinin gözenekli membran üzerinde stabil bir şekilde hareketsiz hale getirilmesine yol açar. (B) Faz kontrast görüntüleri, tohumlamadan hemen sonra (solda) ve tohumlamadan 3-5 saat sonra (sağda) hücrelerin morfolojilerini gösterir. 3 saatlik tohumlamadan sonra gözenekli zar, tek hücrelerin bağlandığı daha ince ve daha koyu alanlar göstererek bağlanma sürecini vurgular. (C) Faz kontrast görüntüleri, bir Çip Üzerinde Bağırsak sistemi içindeki bağırsak tek katmanlarının 3D morfogenezini gösterir. Bu tek tabakalar, IBD'den etkilenen köpeklerden türetilmiştir ve bu organoid hücreler, sıvı akışı ve gerilme hareketlerini içeren dinamik koşullar altında 12 günlük bir süre boyunca kültürlenmiştir. Ölçek çubukları = 50 μm (B,C). Kısaltmalar: IBD = inflamatuar bağırsak hastalığı; ECM = hücre dışı matris; PDMS = polidimetilsiloksan; PEI = polietilenimin; GA = glutaraldehit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65720/65720fig04.jpg"> Şekil 4: Hasta kaynaklı köpek Gut-on-a-Chip'te 3D morfolojik gelişimin değerlendirilmesi. (A) Bir floresan mikroskobu ile değerlendirilen, 12 günlük kültürden sonra tam gelişmiş bir 3D epitelin yukarıdan aşağıya bir görünümünü sergileyen bir köpek IBD Gut-on-a-Chip'in immünofloresan görüntülemesi. Sıkı bağlantı proteini (ZO-1) sarı renkte görselleştirilir; fırça kenarlığı zarı (F-aktin) kırmızı renkte görünür; ve çekirdekler DAPI ile boyanır ve mavi görünür. (B) Uzun mesafeli lensli konfokal mikroskop kullanılarak bir köpek IBD Çip üzerinde Gut-on-a-Chip'in immünofloresan görüntülemesi. Şemada gösterildiği gibi, 12 günlük kültürden sonra tam gelişmiş bir 3D epitelin villus benzeri bir yapısının enine kesitinin floresan görüntüsü gösterilmektedir. Ek olarak, Z-istifleme, villus benzeri yapıların oluşumunu ortaya çıkaran 3D epitelin yandan görünümünü gösterir. Fırça kenarlığı zarı (F-aktin) kırmızı renkte görünür ve çekirdekler DAPI ile boyanır ve mavi görünür. (C) Bağırsak bariyer fonksiyonu, hastadan türetilen köpek Gut-on-a-Chips'te TEER ile değerlendirildi ve ölçüldü. Gut-on-a-Chip'te kültürün 5. gününde stabil TEER değerlerine ulaşıldı. Hata çubukları, ölçümlerin SEM'ini ifade eder. TEER değeri, bir teknik kopya ile iki biyolojik kopya arasında ölçüldü. Ölçek çubukları = 50 μm (A), 25 μm (B). Kısaltmalar: IBD = inflamatuar bağırsak hastalığı; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TEER = transepitelyal elektrik direnci. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Köpek kolonoid türevli tek katmanlarda ve Gut-on-a-Chip cihazlarında anti-ZO-1 poliklonal antikorun karakterizasyonu. (A) ZO-1'in kırmızı F-aktin ile sarı renkte immünofloresan boyanması ve bindirme görüntüleri. Ölçek çubuğu = 25 μm. (B) 'Sızdıran Bağırsak Cipslerinde' sarı renkte ZO-1'in immünofloresan görselleştirmesi, probiyotik bakterilerle stimülasyon (LGG + Sitokinler veya VSL # 3 + Sitokinler) ve probiyotik stimülasyon olmadan mikropsuz kontroller (Sitokinler) dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam Min ve ark.23'ten alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/FigureS1.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S1: Doku bağışçılarının bilgilerinin bir özeti. Donörlerin yaşı, cinsiyeti, cinsi, histopatolojik değerlendirmesi ve köpek IBD aktivite indeksi (CIBDAI) skorunun özet tablosu. CIBDAI, köpek IBD33'te klinik şiddeti anlamak için kullanılan sayısal bir puanlama sistemidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65720/65720_SupplementTable.JoVE.Nagao%20(2).xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Development and Application of a Canine IBD Gut-on-a-Chip Model for 3D Intestinal Morphogenesis Studies at JoVE.com

Köpek bağırsak organoidlerinin ve bir Çip Üzerinde Bağırsak mikroakışkan sisteminin entegrasyonu, insan bağırsak hastalıkları için ilgili translasyonel modeller sunar. Sunulan protokoller, bağırsağın 3D morfogenezine ve dinamik in vitro modellemesine izin vererek, köpeklerde ve insanlarda Tek Sağlık ile bağırsak hastalıkları için etkili tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur.

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal ...

Araştırma hedefimiz, insanlara benzer hayvanlardan, özellikle köpeklerden bağırsak hücrelerini kullanarak 3D yapıları büyütmek için bir yöntem oluşturmaktır. Bağırsak hücresel morfogenezi büyük ölçüde maliyetli, zaman alıcı ve insan gelişim süreçlerini doğru bir şekilde temsil etmeyen laboratuvar hayvanı modelleri aracılığıyla incelenmiştir. Ayrıca, geleneksel statik 2D hücre kültürü modelleri, bir 3D abSerial mimarisinin karmaşık uzamsal organizasyonunu taklit etme yeteneğinden yoksundur.Bağırsak organoidlerinden türetilen tek tek hücrelerin ECM kaplı PDMS yüzeyine bağlanmasını sağlamak önemli bir zorluk teşkil etmiştir. Hem yüzey aktivasyonu yoluyla homojen bir ECM kaplaması sağlamak hem de gece boyunca kurumasını sağlamak için bu zorluğun üstesinden gelmede çok önemli bir adım. Hasta kaynaklı köpek organoid teknolojisinin in vitro 3D Morfogenez ile entegrasyonu, Tek Sağlık Girişimi ile uyumlu olarak kronik multifaktöriyel hastalıklara translasyonel araştırma yapmak için umut verici bir yol sunar.Köpek IBD protokolü, bir çip üzerinde, karşılaştırmalı tıp için tekrarlanabilir bir model sunarak, bağırsak morfogenezi, konak-mikrobiyom etkileşimleri, enfeksiyonlar, ilaç ve probiyotik taramaları üzerine çalışmalara olanak tanır ve türler arası uygulanabilirliğe sahiptir.

three-dimensional-morphogenesis-canine-gut-on-chip-using-intestinal

Research

JoVE Journal

Medicine

Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients

2.0K Görüntüleme.  Washington State University. Araştırma hedefimiz, insanlara benzer hayvanlardan, özellikle köpeklerden bağırsak hücrelerini kullanarak 3D yapıları büyütmek için bir yöntem oluşturmaktır. Bağırsak hücresel morfogenezi büyük ölçüde maliyetli, zaman alıcı ve insan gelişim süreçlerini doğru bir şekilde temsil etmeyen laboratuvar hayvanı modelleri aracılığıyla incelenmiştir. Ayrıca, geleneksel statik 2D hücre kültürü modelleri, bir 3D abSerial mimarisinin karmaşık uzamsal organizasyo...

Video: Yazar Spotlight: 3D Bağırsak Morfogenez Çalışmaları için Köpek IBD Çip Üzerinde Bağırsak Modelinin Geliştirilmesi ve Uygulanması 

Canine intestines possess similarities in anatomy, microbiology, and physiology to those of humans, and dogs naturally develop spontaneous intestinal disorders similar to humans. Overcoming the inherent limitation of three-dimensional (3D) organoids in accessing the apical surface of the intestinal epithelium has led to the generation of two-dimensional (2D) monolayer cultures, which expose the accessible luminal surface using cells derived from the organoids. The integration of these organoids and organoid-derived monolayer cultures into a microfluidic Gut-on-a-Chip system has further evolved the technology, allowing for the development of more physiologically relevant dynamic in vitro intestinal models.
In this study, we present a protocol for generating 3D morphogenesis of canine intestinal epithelium using primary intestinal tissue samples obtained from dogs affected by inflammatory bowel disease (IBD). We also outline a protocol for generating and maintaining 2D monolayer cultures and intestine-on-a-chip systems using cells derived from the 3D intestinal organoids. The protocols presented in this study serve as a foundational framework for establishing a microfluidic Gut-on-a-Chip system specifically designed for canines. By laying the groundwork for this innovative approach, we aim to expand the application of these techniques in biomedical and translational research, aligning with the principles of the One Health Initiative. By utilizing this approach, we can develop more physiologically relevant dynamic in vitro models for studying intestinal physiology in both dogs and humans. This has significant implications for biomedical and pharmaceutical applications, as it can aid in the development of more effective treatments for intestinal diseases in both species.

Integration of canine intestinal organoids and a Gut-on-a-Chip microfluidic system offers relevant translational models for human intestinal diseases. Protocols presented allow for 3D morphogenesis and dynamic in vitro modeling of the gut, aiding in the development of effective treatments for intestinal diseases in dogs and humans with One Health.