Figürler Adobe Illustrator (sürüm 2023) ve Servier Medical Art (https://smart.servier.com) kullanılarak oluşturulmuştur. Antonia Henes, Jürgen Manchot Stiftung tarafından desteklendi.

Tüm CNS Yerleşik Hücre Tiplerinin Otoimmün Farelerden Aynı Anda İzole Edilmesi

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Şimdiye kadar, kütle spektrometresi ve RNA dizilimini birleştirerek CNS'de yerleşik hücreleri ex vivo haritalama yöntemleri, sağlık ve hastalıkta çok hassas bir hücresel profilleme sunmaktadır, ancak bu alanda iddialı teknik bilgi ve uzmanlık gerektirmektedir50,51. Ayrıca, fonksiyonel analizlere izin vermezler ve çok pahalıdırlar. Bunun yanı sıra, mikroakışkan çip üzerinde beyin sistemleri, hastalık mekanizmaları için hızlı ve uygun maliyetli bir tarama ve hücre büyümesi ve göçünün kısıtlanması ile yeni terapötik yaklaşımların test edilmesini sağlar 52,53,54,55. CNS organoidleri, gelecekte hücresel modelleme, hücreler arası bağlantılar ve hastalık seyri sırasındaki etkileşimlerin araştırılması için eşdeğer bir alternatifi temsil edebilir 56,57,58,59. Bununla birlikte, floresan ve manyetik ile aktive olan hücre sınıflandırması, şu anda saf ve canlı tek hücreli süspansiyonlar ex vivo 35,60,61 üretmek için en etkili yöntemlerdir. CNS'de yerleşik hücre tiplerinin izolasyonu için diğer yerleşik üretim protokolleri, manyetik izolasyonun bireysel adımları ve önceki hücre ayrışması ile ilgili olarak benzer olsa bile, her hücre tipi için ayrı ayrı gerçekleştirilmeleri amaçlanmıştır. Buna karşılık, mevcut protokol, her CNS'de yerleşik hücre tipi için farklı izolasyon yöntemlerini mantıksal bir bağlama entegre eder, böylece aynı anda ve tek bir CNS hücre süspansiyonundan gerçekleştirilebilirler (Tablo 1, Tablo 2). Böylece, tek bir CNS hücre süspansiyonundan multi-omik analizlere ve nihayetinde karmaşık nöronal ağların keşfine olanak tanır. Bu protokolü gerçekleştirmek için birden fazla hayvandan birkaç dokuyu bir araya getirmek bir zorunluluk olmasa bile, bu havuzlama, daha fazla aşağı akış analizi için yeterli sayıda izole hücre sağlar. Tek hücre tiplerinin izolasyonu için farklı farelerin kullanılması, potansiyel hücresel etkileşimleri analiz etme olasılığını dışlayacaktır. Bunun yanı sıra, tümü önceki bir CNS ayrışmasını takip eden farklı CNS hücre tipleri için bireysel izolasyon yöntemlerinin birleştirilmesi, sonraki tüm manyetik izolasyon adımları için bir ayrışmış CNS hücre süspansiyonu kullanarak malzeme maliyetlerinden tasarruf sağlar. Ek olarak, farklı farelerin kullanımından kaynaklanan olası bir teknik önyargı en aza indirilir.
Protokolün bir sınırlaması, dişi C57BL / 6J farelerinin neredeyse özel kullanımı olabilir. EAE bağışıklama protokolü dişi fareler için tasarlanmış ve oluşturulmuştur, bu nedenle bu hücre izolasyon protokolü dişi C57BL / 6J farelerinde de uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu protokolün geliştirilmesi sırasında, ortaya çıkan hücre sayısı veya saflıkları üzerinde herhangi bir etki tanınmadan, saf erkek fareler de kullanılmıştır. Başka bir kısıtlama, nöronların manyetik hücre izolasyonunu etkiler, çünkü pozitif bir seçim açısından nöronların izolasyonu için spesifik bir mikro boncuk yoktur. Biyotin etiketlemesi ve tüm nöronal olmayan hücrelerin tükenmesi yoluyla saf bir tek hücreli süspansiyonun elde edilebileceği varsayılmıştır (Tablo 2). Bu varsayım, NeuN'nin söz konusu akış sitometrisi saflık paneline entegre edilmiş nöronlar için spesifik bir nükleer belirteç olarak kullanılmasıyla doğrulandı. Diğer bir sınırlama, EAE farelerinde mikroglia izolasyonu ile ilgilidir. Burada elde edilen hücre verimleri, MACS protokolünden sonra ek sıralama adımı nedeniyle diğer hücre tiplerine göre azalır. Ayrıca, sıralamanın diğer hücre popülasyonlarına kıyasla mikroglia'nın mekanik stresini arttırdığı iddia edilebilir. Bireysel sıralama stratejileri, farklı miktarlarda hücre verimine yol açabilir. İzole hücre sayısı beklenenden veya istenenden azsa, geçit kurulumunun ayarlanması ve/veya canlı/ölü ayrımının iyileştirilmesi önerilir.
Protokoldeki kritik bir adım, enkazın kaldırılmasını temsil eder. İstenen üç ayrı fazı oluşturmak için gradyan çok yavaş ve nazikçe katmanlanmalıdır (Şekil 2A). Sadece iki üst fazdaki miyelin ve diğer kalıntı kalıntıları tamamen çıkarılırsa (Şekil 2E), saf tek hücreli süspansiyonlar üretilebilir ve daha fazla kontaminasyon azaltılabilir. Ortaya çıkan hücre süspansiyonları saflıktan yoksunsa, bu muhtemelen tüm mikro boncukların doğru kullanımının güvencesinin yanında ilk önce iyileştirilmesi gereken protokolün bölümüdür.
Bu tür deneylerde saflık ve canlılıkta yüksek seviyeler elde etmek zor olabilir. Sorun giderme için bazı öneriler şunlardır:
-Farklı mikro boncukların kontaminasyonunu önlemek ve özellikle sonraki yetiştirme için tekrarlanan kullanımı sağlamak için steril koşullar altında çalışmak zorunludur. -Karışıklıkları önlemek için her tüpün etiketlenmesi şiddetle tavsiye edilir. -Soğutulmamış reaktiflerin/tamponların kullanımından kaçının. Yüksek canlılık sağlamak için tüm deney boyunca tüm hücre süspansiyonlarını buz üzerinde saklayın. -Farklı çalışma adımları arasındaki süreyi mümkün olduğunca kısa tutun. Protokolde denemenin duraklatılmasının önerildiği belirli bir bölüm yoktur. -Belirtilen kuluçka sürelerine uymak son derece önemlidir.
Sonuç olarak, tüm ana CNS'de yerleşik hücre tiplerinin bir CNS replikasyonundan eşzamanlı izolasyonu için bu mevcut protokol, karmaşık nöronal ağları ve nöroinflamatuar yolları ex vivo olarak bir CNS hücre süspansiyonundan analiz etme imkanı sunar. Bu nedenle, CNS'de yerleşik hücreler, hastalık seyrinin farklı aşamalarında, örneğin nöroinflamasyon, nörodejenerasyon ve / veya EAE'de remisyon sırasında araştırılabilir. Ayrıca, hücre-hücre etkileşimleri ve biyokimyasal yollar bireysel düzeyde incelenebilir ve deney grupları içindeki değişkenlik azaltılabilir. Ayrıca, daha fazla fonksiyonel tahlil ve doğrulama için izole edilmiş CNS hücrelerinin fraksiyonlarını monokültürlerde yetiştirme fırsatı da vardır. Hepsi bir arada, bu protokol klinik öncesi ve klinik araştırma yaklaşımlarını potansiyel olarak etkileyen önemli ilerlemeler sunar.

Multipl skleroz (MS), santral sinir sisteminin (SSS) demiyelinizasyon, aksonal hasar, gliozis ve nörodejenerasyon ile karakterize kronik inflamatuar otoimmün bir hastalığıdır. Bu alandaki çok sayıda araştırma yaklaşımına rağmen, MS'in patofizyolojisi hala tam olarak anlaşılamamıştır 1,2,3,4. MS'i araştırmak için en yaygın hayvan modeli, klinik ve patofizyolojik özelliklerinin çoğunu paylaşan miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi 35-55 (MOG35-55) ile indüklenen deneysel otoimmün ensefalomiyelittir (EAE) 5,6,7,8,9 . Bağışıklık sisteminin inflamasyona, demiyelinizasyona ve nöroaksonal dejenerasyona yol açan CNS'ye özgü antijenlere karşı tepkisine dayanır. Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), MS'de bulunan nöroinflamatuar yolakların ve sinyal kaskadlarının araştırılması için uygun bir modeldir.
MS için mevcut tedavi seçenekleri sadece kısmen etkilidir ve öncelikle hastalığın ilk inflamatuar fazına odaklanır. Bununla birlikte, MS'in nörodejeneratif bileşeni, uzun vadeli terapötik yaklaşımlar için en büyük zorluk gibi görünmektedir. Bu nedenle, otoimmün hastalıklarda moleküler ve hücresel mekanizmaların kapsamlı bir şekilde araştırılması için tekrarlanabilir ve hassas hücre izolasyon protokollerine ihtiyaç vardır. Tek bir hücre tipinin izolasyonu için bazı protokoller mevcut olsa bile 10,11,12,13,14,15, aynı anda birkaç CNS'de yerleşik hücre popülasyonunun aynı anda izolasyonu için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. CNS'de yerleşik hücrelerin izolasyonu için önceki protokoller, hücresel işlevselliği ve saflığı korumada eksiktir, bu da komşu hücrelerle birlikte yetiştirme 16,17,18 veya hücre içi ağların ex vivo19,20,21,22 karmaşık analizleri için uygun olmama ile sonuçlanır.
Bu protokolün amacı, yetişkin, sağlıklı ve EAE farelerinde uygulanabilen tüm ana CNS'de yerleşik hücre tiplerinin saf, canlı, tek hücreli süspansiyonlarının eşzamanlı izolasyonu için tekrarlanabilir ve kapsamlı bir yöntem oluşturmaktı. Farklı hücre tipleri, manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması (MACS)23 kullanılarak izole edildi. Hücre ayrımı, pozitif seleksiyonla, yani hücre tipine özgü yüzey işaretleyicilerinin manyetik olarak etiketlenmesiyle veya biyotinilasyon ve tüm istenmeyen hücrelerin tükenmesi yoluyla negatif seleksiyonla gerçekleştirilebilir. İzole edilmiş tek hücreli süspansiyonların %90'ın üzerinde bir saflık ve en az %80'inin canlılığını sağlamak için akış sitometrisi uygulandı.
Sonuç olarak, ana amaç, sağlıklı ve EAE farelerinde karmaşık hücresel ağların ve biyokimyasal sinyal kaskadlarının kapsamlı ve kesin bir analizini sunan nöroinflamatuar yolların araştırılması için çok yönlü bir araç olarak tüm ana CNS'de yerleşik hücre tiplerinin eşzamanlı izolasyonu için bir protokol oluşturmaktı.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 &#956;m cell strainers</td>
			<td>Corning, MA, USA</td>
			<td>352350</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACSA-2 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 615 (clone REA-969)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-116-244</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Brain Dissociation Kit, mouse, and rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-107-677</td>
			<td>Tissue dissociation,contains debris and red blood cell removal solutions; prepare aliquots of enzyme A and P upon arrival and store them at -20 &#176;C; store the remaining kit at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ACSA-2 MicroBead Kit, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-097-678</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 antibody&#160;</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>101301</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-O4 MicroBeads, human, mouse, rat</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-094-543</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AstroMACS Separation buffer</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>MACS of astrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Antibody, PE (clone Bio3-18E7)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-113-853</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRAND Neubauer counting chamber</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10195580</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 510 anti-mouse CD45 Antibody (clone 30-F11)</td>
			<td>BioLegend, London, UK</td>
			<td>103137</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads, human, mouse</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-049-601</td>
			<td>MACS of microglia, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I, recombinant, Rnase-free</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>4716728001</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS with Calcium, Magnesium, Glucose, Pyruvat</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14287080</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-PBS, without calcium, without magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>14190250</td>
			<td>Buffer, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 780</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience Foxp3/Transcription factor staining buffer set</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>00-5523-00</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (15 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>11507411</td>
			<td>Cell tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon (50 mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>10788561</td>
			<td>Cell tube&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#160;Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>08-771-23</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-092-575</td>
			<td>MACS of oligodendrocytes, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female C57BL/6J mice</td>
			<td>Charles River Laboratories, Sulzfeld, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>F2442-50ML</td>
			<td>Flow cytometry, store at -5 to -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Rat Anti-CD 11b&#160; (clone M1/70)</td>
			<td>BD Biosciences, San Jose, CA, USA</td>
			<td>553310</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freund&#8217;s Complete adjuvant</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>AR001</td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS C Tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACS Octo Dissociator with Heaters</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-096-427</td>
			<td>CNS tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 8.4.3</td>
			<td>Graphpad by Dotmatics</td>
			<td></td>
			<td>Graphical Analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>AbbVie, North Chicago, IL, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaluza Analysis Software V2.1.1</td>
			<td>Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td>Flow cytometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>PB-buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>MACS&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOG35&#8211;55 peptide</td>
			<td>Charit&#233;, Berlin, Germany; alternatives: Genosphere Biotechnologies (Paris, France) or sb-Peptide (Saint Egr&#232;ve, France)</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycobacterium tuberculosis strain H37 Ra</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD),Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td></td>
			<td>Active EAE induction, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neuron Isolation Kit, mouse&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-115-390</td>
			<td>MACS of neurons, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O4 Antibody, anti-human/mouse/rat, APC, (clone REA-576)</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-119-897</td>
			<td>Flow cytometry, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pertussis toxin in glycerol</td>
			<td>Hooke Laboratories Inc., Lawrence, MA, USA</td>
			<td>BT-0105</td>
			<td>Active EAE induction; store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pluriStrainer Mini 100 &#956;m&#160;</td>
			<td>pluriSelect Life Science UG, Leipzig, Sachsen, Germany</td>
			<td>43-10100-40</td>
			<td>Flow cytometry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, NRW, Germany</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 647 Anti-NeuN antibody (clone EPR12763)</td>
			<td>Abcam, Cambridge, UK</td>
			<td>EPR12763</td>
			<td>Flow cytometry, store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Brain Matrices, 1 mm</td>
			<td>Ted Pella, Redding, CA, USA</td>
			<td>15067</td>
			<td>CNS tissue dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Cell counting&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5&#160;M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA</td>
			<td>15575020</td>
			<td>Flow cytometry, store at room temperature</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous isolation of principal central nervous system-resident cell types from adult autoimmune encephalomyelitis mice

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE), multipl skleroz (MS) için en yaygın murin modelidir ve MS'in hala bilinmeyen etiyolojisini daha fazla aydınlatmak ve yeni tedavi stratejileri geliştirmek için sıklıkla kullanılmaktadır. Miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi 35-55 (MOG35-55) EAE modeli, bağışıklamadan sonraki 10 gün içinde artan felç ile kendi kendini sınırlayan bir monofazik hastalık seyrini yeniden üretir. Fareler, klinik bir puanlama sistemi kullanılarak günlük olarak incelenir. MS, belirli bir zamansal paterne sahip farklı patomekanizmalar tarafından yönlendirilir, bu nedenle hastalığın ilerlemesi sırasında merkezi sinir sistemi (MSS) yerleşik hücre tiplerinin rolünün araştırılması büyük ilgi görmektedir. Bu protokolün benzersiz özelliği, yetişkin EAE ve sağlıklı farelerde uygulanabilen tüm ana CNS'de yerleşik hücre tiplerinin (mikroglia, oligodendrositler, astrositler ve nöronlar) eşzamanlı izolasyonudur. Beynin ve omuriliğin yetişkin farelerden ayrılmasını, mikroglia, oligodendrositler, astrositler ve nöronları izole etmek için manyetik olarak aktive edilen hücre sınıflandırması (MACS) takip eder. Saflaştırılmış tek hücreli süspansiyonların kalite analizlerini yapmak için akış sitometrisi kullanıldı, hücre izolasyonundan sonra canlılığı doğruladı ve her hücre tipinin saflığını yaklaşık %90 olarak gösterdi. Sonuç olarak, bu protokol, sağlıklı ve EAE farelerinde karmaşık hücresel ağları analiz etmek için kesin ve kapsamlı bir yol sunar. Ayrıca, dört hücre tipinin tümü aynı farelerden izole edildiğinden, gerekli fare sayıları önemli ölçüde azaltılabilir.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by demyelination, axonal damage, gliosis, and neurodegeneration. Despite numerous research approaches in this field, the pathophysiology of MS is still not fully understood1,2,3,4. The most common animal model for investigating MS is the myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide 35-55 (MOG35-55)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) which shares many of its clinical and pathophysiological features5,6,7,8,9. It is based on the response of the immune system against CNS-specific antigens leading to inflammation, demyelination, and neuroaxonal degeneration. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a suitable model for the investigation of neuroinflammatory pathways and signaling cascades found in MS.
Current therapy options for MS are only partially effective and focus primarily on the initial inflammatory phase of the disease. However, the neurodegenerative component of MS seems to be the major challenge for long-term therapeutic approaches. Therefore, reproducible, and precise cell isolation protocols are required to investigate molecular and cellular mechanisms in autoimmune diseases in a comprehensive way. Even if some protocols for the isolation of one single cell type exist10,11,12,13,14,15, there is an unmet need for the simultaneous isolation of several CNS-resident cell populations at once. Previous protocols for the isolation of CNS-resident cells lack in preserving cellular functionality and purity, resulting in co-cultivation with neighboring cells16,17,18 or the unsuitability for complex analyses of intracellular networks ex vivo19,20,21,22.
The aim of this protocol was to establish a reproducible and comprehensive method for the simultaneous isolation of pure viable single-cell suspensions of all principal CNS-resident cell types applicable in adult healthy and EAE mice. The different cell types were isolated using magnetic-activated cell sorting (MACS)23. The cell separation can be accomplished either by positive selection, i.e., magnetic labeling of cell-type-specific surface markers, or by negative selection via biotinylation and depletion of all undesired cells. Flow cytometry was applied to ensure a purity of above 90% and a viability of at least 80% of the isolated single-cell suspensions.
In conclusion, the main goal was to establish a protocol for the simultaneous isolation of all main CNS-resident cell types as a versatile tool for the investigation of neuroinflammatory pathways offering a comprehensive and precise analysis of complex cellular networks and biochemical signaling cascades in healthy and EAE mice.

Yazar Spotlight: Tüm Ana CNS'de Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu Yoluyla Nöroinflamatuar Yolların İncelenmesi 

Yetişkin Otoimmün Ensefalomiyelit Farelerinden Başlıca Merkezi Sinir Sisteminde Yerleşik Hücre Tiplerinin Eşzamanlı İzolasyonu

To investigate molecular and cellular mechanisms in autoimmune diseases such as multiple sclerosis, the generation of reproducible and sophisticated cell isolation protocols is an unmet need. Most of the current technologies to isolate and analyze CNS-resident cells show serious shortcomings, such as focusing on only one cell type or only postnatal mice. The current protocol for the simultaneous isolation of all main CNS-resident cell types from one CNS replicate offers the possibility to analyze complex neuronal networks and new inflammatory pathways, ex vivo from one single cell suspension, applicable to healthy mice and those with experimental autoimmune encephalomyelitis.Additionally, mice numbers are decreased Our protocol for the simultaneous isolation of all four major CNS-resident cell types in healthy and EAE mice could be used as a helpful tool for research groups studying new inflammatory pathways, allowing a much more accurate analysis of complex biomolecular mechanisms and cellular networks ex vivo. New scientific questions that could be answered with the help of our protocol are dynamic investigations in EAE during different stages of disease course, like neuroinflammation, neurodegeneration, and remission. Also, cell-cell interactions and biochemical pathways could be studied on an individual level.Likewise, functional assays could be performed with cultivated cells. We intend to focus on dynamic studies of the EAE course for multi-omic analysis from one individual CNS homogenate per EAE time point.

Mevcut protokol, tüm ana CNS'de yerleşik hücreleri, yani mikroglia, oligodendrositler, astrositler ve nöronları tek bir CNS replikasyonundan aynı anda izole etme imkanı sunar. Bu, bu tür deneyler için gerekli olan fare sayısının azaltılması ve moleküler ve biyokimyasal analizlerin hücresel düzeyde karşılaştırılabilirliğini sağlamak için önemlidir. Bireysel hücre tipleri farklı CNS kopyalarından izole edilirse, hücresel etkileşimler doğru bir şekilde haritalanamaz ve izolasyon işlemleri sırasındaki potansiyel teknik sapmalar, daha sonraki aşağı akış analizlerini önyargılı hale getirebilir. Ek olarak, her hücre tipinden elde edilen moleküler ve biyokimyasal bulgular, aynı EAE bağlamından türetilmedikleri için birbirleriyle karşılaştırılamaz. Ticari bir sistem/kit kullanan önceden var olan bir MACS protokolü, yukarıda belirtilen hücre tiplerinin eşzamanlı izolasyonunu sağlamak için uyarlanmıştır.
Mikroglia izolasyonu anti-CD11b mikro-boncuklar kullanılarak gerçekleştirildi, oligodendrositler anti-O4-beads ile izole edildi (Tablo 1) ve astrositleri izole etmek için anti-ACSA-2 mikro-boncuklar kullanıldı (Tablo 2). Buna karşılık, nöronların izolasyonu negatif bir seçimi temsil eder ve tüm nöronal olmayan hücrelerin biyotinilasyonu ve manyetik etiketlemesi ile gerçekleştirilmiştir (Tablo 2). Kan hücreleri dışındaki tüm nöronal olmayan hücreler (örneğin, oligodendrositler, mikroglia, astrositler, endotel hücreleri ve fibroblastlar), özellikle bu nöronal olmayan hücrelerde eksprese edilen bir yüzey antijenine karşı yönlendirilmiş bir biyotin konjuge antikor kullanılarak manyetik olarak etiketlenebilir (Tablo 2). Bu manyetik olarak etiketlenmiş nöronal olmayan hücrelerin tükenmesiyle, oldukça saf ve canlı nöronal hücre popülasyonları üretilebilir 30,42,43.
Üretilen tek hücreli süspansiyonların saflık analizleri için iki yeni akış sitometri paneli tasarlandı. Burada, canlı/ölü hücre ayrımı ile birlikte hücre tipine özgü yüzey ve nükleer belirteçler kullanıldı.
Fare ve hücre tipi başına elde edilen hücre verimleri (Şekil 3A) analiz edildi ve ortalama 8'e yol açtı. 4 x 105 ± 3 x 104 mikroglia, 3.23 x 106 ± 1 x 105 oligodendrosit, 8.6 x 105 ± 2 x 104 astrosit ve 4.5 x 105 ± 1 x 104 nöron.
Nöroinflamasyonun hastalık modellerini araştırmak amacı bağlamında, protokol EAE'nin bir fare modeline de uygulanmıştır. Fareler, EAE indüksiyonundan sonra 16. günde ötenazi yapıldı ve hastalık maksimumunu temsil edildi. Bu EAE ortamında yaklaşık 2.9 x 106 ± 6.7 x 105 oligodendrosit, 5.2 x 105 ± 9 x 104 astrosit ve 4.4 x 105 ± 4 x 104 nöron izole edildi. Mikroglia hücre verimi, MACS adımlarından sonra ek hücre sıralaması nedeniyle EAE faresi başına yaklaşık 1.7 x 105 ± 4 x 104 mikrogliaya düşürüldü (Şekil 3A).
İzolasyondan sonra, akış sitometrisi yoluyla farklı hücre popülasyonlarının fenotipik karakterizasyonları, tüm ana CNS'de yerleşik hücre tipleri için yaklaşık% 90 saflığa sahip canlı tek hücreli süspansiyonların elde edilebileceğini kanıtladı (Şekil 3B). Mikroglia, literatürde tanımlandığı gibi CD45intCD11byüksekliğinde 44,45,46,47 olarak tanımlandı.
EAE'de, mikroglia, nöroinflamasyon sırasında CNS'ye göç eden monositler, nötrofiller, doğal öldürücü hücreler, granülositler ve makrofajlar gibi diğer CD11b+ bağışıklık hücrelerinden ayırt etmek için tüm CD11b+ hücrelerinden ayrılmak zorunda kaldı 27,28,48. Bu nedenle, mikroglialar CD11b+ hücre süspansiyonundan CD45intCD11yüksek hücreleri olarak sınıflandırıldı. Tüm mikroglia sıralama stratejisi Şekil 4'te gösterilmektedir. Saf farelerde, mikroglia popülasyonu tüm canlı tek hücrelerin% 91.16'sıydı (toplam CD11b + popülasyonunun% 96'sı) (Şekil 4A). EAE farelerinde, mikroglia popülasyonu tüm canlı tek hücrelerin% 46.85'i idi (toplam CD11b + popülasyonunun% 55'i) (Şekil 4B). Hem MACS hem de FACS prosedürleri tek hücrelere mekanik stres uygulasa da, sıralanan saflaştırılmış mikrogliaların %75.41 ± %8.63'ü yaşayabilirdi (Şekil 3B).
İlk CNS hücre süspansiyonundan doğrudan izole edilen astrositler ve nöronlar, oligodendrositlerle ilgili kontaminasyon gösterdi, bu da nöronların ve astrositlerin oligodendrositlerin negatif akışından eşzamanlı izolasyonunun bu kontaminasyonu önleyebileceği varsayımına yol açtı. Akış sitometrisi analizleri, oligodendrositlerin negatif akışından izole edilen astrositlerin %89.23 ± %2.78 saflıkta olduğunu ve %80.56 ± %1.41 canlılık gösterdiğini doğruladı. Bu sonuçlara benzer şekilde, O4 hücre fraksiyonundan izole edilen nöronların saflığı %81.25 ± %3.31 ve canlılığı %83.90 ± %2.61 idi (Şekil 3B). Bu bulgular ayrıca, bu iki hücre tipinin eşzamanlı izolasyonunun, ancak oligodendrositlerin izolasyonundan sonra, canlı fonksiyonel hücrelerin miktarı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını doğrulamaktadır.
İzole edilmiş tek hücreli süspansiyonların canlılığı ve saflığı ile ilgili sonuçlar, EAE farelerinde, saf farelerde alınanlara kıyasla çok benzerdi ve bu protokolün EAE bağlamında olduğu kadar sağlıklı fareler için de uygun olduğunu doğruladı (Şekil 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig03.jpg"> Şekil 3: İzole edilmiş CNS'de yerleşik hücrelerin hücre verimleri ve akış sitometrisine dayalı doğrulaması. (A) Saf ve EAE farelerde CNS'de yerleşik hücrelerin izolasyonundan sonra fare ve hücre tipi başına hücre verimi. Çubuk grafikler, sunulan protokolün uygulanmasından sonra fare ve hücre tipi başına hücre verimi miktarını görselleştirir. Saf farelerde sonuçlar için beş biyolojik kopya işlendi ve EAE farelerinde dört biyolojik kopya analiz edildi. İlgili araçlar ± SEM'ler tasvir edilmiştir. (B) Saflaştırılmış hücre fraksiyonlarının karşılık gelen saflık ve canlılık analizleri. Çubuk grafikler, hücre tipine özgü belirteçlerin ekspresyonlarına dayalı olarak ortaya çıkan tek hücreli süspansiyonların canlılığını ve saflığını gösterir. NeuN, nöronlar için hücre tipine özgü bir nükleer belirteç olarak kullanıldı. Hem sağlıklı hem de EAE fareleri için her hücre tipi için beş biyolojik kopya elde edildi ve karşılaştırıldı. İlgili araçlar ± SEM'ler belirtilmiştir. Kısaltmalar: Anti-ACSA-2 = astrosit hücre yüzeyi antijeni-2; CD11b = sikline bağımlı kinaz 11B; CD45 = reseptör tipi tirozin-protein fosfataz C; CNS = merkezi sinir sistemi; EAE = deneysel otoimmün ensefalomiyelit; MACS = manyetik olarak aktive edilen hücre sıralaması; NeuN = RNA bağlayıcı protein tilki-1 homolog 3; O4 = oligodendrosit belirteci O4; SEM = ortalamanın standart hatası. Bu rakam49'dan değiştirildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65735/65735fig04.jpg"> Şekil 4: CD11b+ hücrelerinin izolasyonundan sonra mikroglia'nın hücre sıralaması için geçit stratejisi. (A) Saf ve (B) EAE farelerinde geçit stratejisi. Her panelin üst satırı, sıralamadan önce nokta grafiklerini ve sıralamadan sonra alt satırı gösterir. Canlı (SSC-A/FSC-A) ve tek hücreli (FCS-H/FSC-W) hücre seçiminden sonra, CD45intCD11b+ hücre popülasyonu mikroglia popülasyonu olarak sınıflandırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65735/65735fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Studying Neuroinflammatory Pathways Through Simultaneous Isolation of All Main CNS-Resident Cell Types at JoVE.com

Bugüne kadar, tüm ana merkezi sinir sisteminde yerleşik hücre tiplerinin aynı fareden eşzamanlı izolasyonu için protokoller karşılanmamış bir taleptir. Protokol, nöroinflamasyon sırasında karmaşık hücresel ağları araştırmak ve aynı anda gerekli fare sayılarını azaltmak için naif ve deneysel otoimmün ensefalomiyelit farelerinde uygulanabilir bir prosedürü göstermektedir.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common murine model for multiple sclerosis (MS) and is frequently used to further elucidate ...

Multipl skleroz gibi otoimmün hastalıklarda moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için tekrarlanabilir ve sofistike hücre izolasyon protokollerinin oluşturulması karşılanmamış bir ihtiyaçtır. CNS'de yerleşik hücreleri izole etmek ve analiz etmek için mevcut teknolojilerin çoğu, yalnızca bir hücre tipine veya yalnızca doğum sonrası farelere odaklanmak gibi ciddi eksiklikler göstermektedir. Tüm ana CNS'de yerleşik hücre tiplerinin bir CNS replikasyonundan eşzamanlı izolasyonu için mevcut protokol, sağlıklı farelere ve deneysel otoimmün ensefalomiyelitli olanlara uygulanabilen, tek bir hücre süspansiyonundan ex vivo olan karmaşık nöronal ağları ve yeni enflamatuar yolları analiz etme imkanı sunar.Ek olarak, fare sayıları azalır Sağlıklı ve EAE farelerinde dört ana CNS'de yerleşik hücre tipinin tümünün eşzamanlı izolasyonu için protokolümüz, yeni enflamatuar yolları inceleyen araştırma grupları için yararlı bir araç olarak kullanılabilir ve karmaşık biyomoleküler mekanizmaların ve hücresel ağların çok daha doğru bir analizine olanak tanır. Protokolümüz yardımıyla cevaplanabilecek yeni bilimsel sorular, EAE'de nöroinflamasyon, nörodejenerasyon ve remisyon gibi hastalık seyrinin farklı aşamalarında dinamik araştırmalardır. Ayrıca, hücre-hücre etkileşimleri ve biyokimyasal yollar bireysel düzeyde incelenebilir.Benzer şekilde, ekili hücrelerle fonksiyonel testler yapılabilir. EAE zaman noktası başına bir CNS homojenatından multi-omik analiz için EAE kursunun dinamik çalışmalarına odaklanmayı amaçlıyoruz.

simultaneous-isolation-principal-central-nervous-system-resident-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous Isolation of Principal Central Nervous System-Resident Cell Types from Adult Autoimmune Encephalomyelitis Mice

736 Görüntüleme.  Heinrich Heine University Duesseldorf. Multipl skleroz gibi otoimmün hastalıklarda moleküler ve hücresel mekanizmaları araştırmak için tekrarlanabilir ve sofistike hücre izolasyon protokollerinin oluşturulması karşılanmamış bir ihtiyaçtır. CNS'de yerleşik hücreleri izole etmek ve analiz etmek için mevcut teknolojilerin çoğu, yalnızca bir hücre tipine veya yalnızca doğum sonrası farelere odaklanmak gibi ciddi eksiklikler göstermektedir. Tüm ana CNS'de yerleşik hücre tiplerinin bir CNS replikasyonundan...