Araştırmamız epigenetik kalıtım mekanizmasına odaklanmaktadır. Spesifik olarak, DNA replikasyonu, epigenetik kalıtımda ilk yayma adımını temsil eden ebeveyn histon geri dönüşüm sürecini birleştirdi. DNA replikasyonunda yer alan çoklu ebeveyn histon birikiminin ebeveyn histon geri dönüşümünde önemli rol oynadığı tespit edilmiştir.
Bu, D helikaz kompleksi, DNA polimeraz ve koruma kompleksi için replikasyonu içerir. Geleneksel genetik ve biyokimyasal yaklaşımlar bu araştırma alanında kullanılan değerler olmuştur. Geleneksel olarak, ebeveyn histon transfer sürecini anlamak için yüksek verimli dizileme yöntemleri kullanılmaktadır.
Proteinle ilişkili DNA'nın zenginleştirilmesi ve dizilenmesi veya deney yöntemi geliştirilmeden önce, ebeveyn histon transfer sürecini incelemek zordu. Deney yöntemi, bu temel soruları ele almak için güçlü bir araç sağladı. Başlamak için, maya hücresi peletlerini törpüleyin ve hafif girdaplama ile yeniden askıya alın.
Daha sonra aynısını proteaz inhibitörleri içeren 0.4 mililitre CHIP lizis tamponu ve bakteriyel kontaminasyonu önlemek için bir antibiyotik karışımı ile yıkayın. Karışımı bir dakika boyunca 5.000 G'de santrifüjleyin. Daha sonra, pelete proteaz inhibitörleri ve antibiyotik karışımı içeren 0.1 mililitre CHIP lizis tamponu ekleyin.
Bunu yaklaşık 100 mikrolitre 0,5 milimetre cam boncuk takip ediyor. Hücreleri, dört santigrat derece soğuk odada üç döngü boyunca boncuk boncuk ile parçalayın. 16 gauge sıcak iğne kullanarak tüpün altına delikler açın.
Delinmiş tüpü 1.5 mililitrelik boş bir DNA düşük bağlayıcı tüpe yerleştirerek lizatı toplayın ve oda sıcaklığında iki dakika boyunca 1.600 G'de santrifüjleyin. Peletleri rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre kalıntısı fraksiyonu kromatini içerecektir.
0.35 mililitre takviye edilmiş Mikrokok nükleaz veya MNaz sindirim tamponu içinde pipetleyerek hücre peletlerini yeniden süspanse edin. Ardından, süspansiyona 10 birim MNase ekleyin. Dört ila altı kez ters çevirerek nazikçe karıştırın ve 37 santigrat derece su banyosunda 20 dakika inkübe edin.
10 milimolar nihai konsantrasyona beş mikrolitre 0.5 molar EDTA ekleyerek MNase sindirimini söndürün. Ters çevirerek hafifçe karıştırın ve tüpü en az 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 1.5 mililitre Bioruptor mikrotüpleri kullanarak, reaksiyon karışımını 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı döngülerle üç dakika boyunca yüksek güçte sonikleştirin.
Ardından, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 10.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10.000 G'de tekrar santrifüjleyin. Ardından, süpernatanın yaklaşık 400 mikrolitresini toplayın.
DNA ekstraksiyonu için giriş DNA'sı olarak 30 mikrolitre kaydedin ve eksi 20 santigrat derecede dondurun. Histon kromatin immünopresipitasyonu için kalan 370 mikrolitre hücre lizatını kullanın. Başlamak için, daha önce elde edilen girdi ve H3K4me3 CHIP numunelerinin yaklaşık 150 mikrolitresini 100 santigrat derecelik bir ısı bloğunda kaynatın Beş dakika boyunca, numuneyi hemen beş dakika buz üzerinde soğutun.
Ardından, belirtilen bileşenlerden gerekli miktarda numuneye ekleyin. Numuneyi dört santigrat derece ve 10 RPM'de bir rotor üzerinde iki saat boyunca mutasyona uğratın. Karışımı, 20 mikrolitre yıkanmış protein G Sefaroz boncukları içeren 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın.
Karışımı, rotor üzerinde 10 RPM'de dört santigrat derecede bir saat boyunca mutasyona uğratın. Tüpleri oda sıcaklığında 800 G'de bir dakika döndürün. Boncukları bir mililitre soğuk Bromo-deoksiuridin veya her yıkama için üç dakika döndüren BrdU immünopresipitasyon tamponu ile üç kez yıkayın.
Tüpü tekrar santrifüjleyin ve üç dakika boyunca bir mililitre TE tamponu ile yıkayın. Tüpleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 800 G'de tekrar döndürün ve süpernatanı dikkatlice aspire edin. Boncuklara %1 SDS içeren 100 mikrolitre TE tamponu ekleyin.
Karışımı 65 santigrat derecede beş dakika inkübe edin, ardından oda sıcaklığında bir dakika boyunca 800 G'de döndürün. BrdU immünopresipitasyon ve H3K4me3 eSPAN örneklerini elde etmek için DNA saflaştırma kolonlarını kullanarak süpernatanı 18 mikrolitre elüsyon tamponuna saflaştırın. Tek sarmallı DNA kitaplığını, ssDNA ve düşük girdili DNA kitaplığı hazırlama kiti kılavuzunu izleyerek belirtilen örneklerle hazırlayın.
Ligasyon ürününü 20 mikrolitre düşük EDTA'lı Elüsyon tamponuna saflaştırın. Tek sarmallı DNA kütüphanesi hazırlama kitinden 50 mikrolitre reaksiyon karışımı kullanarak DNA kütüphanesini çoğaltın. Görüntülenen döngüyü takiben, PCR karışımını yükseltin.
PCR ürünlerini, önceden 30 santigrat dereceye ısıtılmış 60 mikrolitre boncukla karıştırarak saflaştırın. PCR ürünlerini ve boncukları iyice karıştırın. Karışımı oda sıcaklığında beş dakika bekletin.
Boncukları manyetik bir standa üç dakika boyunca bağlayın ve 200 mikrolitre taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın. Boncukları iki dakika havayla kurutun ve DNA'yı DNA kütüphanesi hazırlama kitinde sağlanan 20 mikrolitre düşük EDTA'lı tampona seyreltin. Yüksek çözünürlüklü elektroforez sistemlerini kullanarak kütüphane konsantrasyonunu ve parça boyutu dağılımını ölçün.
Paralel eşleştirilmiş uç dizileme gerçekleştirmek için giriş H3K4me3 kromatin immünopresipitasyonu, BrdU immünopresipitasyonu, eSPAN örnekleri dahil olmak üzere eşit miktarda bireysel kitaplığı bir araya getirin. H3K4me3 eSPAN'ın DNA dizileme kütüphanesinin tipik bir jel analizi, bir kromatin nükleozom merdiven modeli ortaya çıkardı. Ana mononükleozom bandı, adaptörlerin sindirimden elde edilen DNA parçasına eklendiği 270 baz çiftinde ortaya çıktı.
Farklı numune haritalaması, vahşi tip ve mcm2-3A hücrelerinde orijini otonom olarak kopyalayan 607 dizisini çevreleyen bireysel nükleozomlarda zirveler ortaya çıkardı. Ortalama iplik yanlılığı, yabani tip maya hücrelerinde, ebeveyn histon birikiminin, gecikmeli ipliğe doğru hafif bir eğilim sergilediğini ortaya koydu. Bununla birlikte, mutant ebeveyn histonunda H3H4 önde gelen ipliğe aktarıldı.
