Наша многопрофильная группа пытается понять, как инфекционный белок, прион, может выполнять сложные биологические задачи. Нас также интересует, как прионы могут сохраняться в окружающей среде в течение многих лет или десятилетий. После процедур деконтаминации прионов надежный метод определения эффективности инактивации прионов был недоступен.
Мы пытаемся решить эту проблему с помощью наших исследований. Метод взятия мазка в сочетании с RT-QuIC позволяет отбирать пробы широкого спектра поверхностей для обнаружения активности засева прионов. Это может быть использовано для обнаружения поверхностно ассоциированных прионов в лабораторных, клинических условиях или в условиях окружающей среды.
Мне интересно понять, как прионы взаимодействуют с поверхностями и каковы требования к поверхностно связанным прионам для развития инфекции. Для начала определите и пометьте соответствующие зоны наблюдения для взятия мазков. Подготовьте две микроцентрифуги объемом 1,5 миллилира для каждой выявленной области и добавьте 250 микролитров DPBS в первую пробирку, оставив вторую пустой.
Извлекайте тампоны с пенопластовыми наконечниками из хранилища в месте, свободном от прионных загрязнений. Подготовьте положительный и отрицательный контроль с использованием соответствующих гомогенатов мозга или BH в DPBS. В чистых перчатках достаньте необходимое количество поролоновых тампонов из упаковки и положите их ручкой вниз в штатив для пробирок.
Следите за тем, чтобы наконечники не соприкасались с другими поверхностями. Держа за ручку чистый поролоновый тампон, нанесите на наконечники тампона 50 микролитров соответствующих положительных и отрицательных контрольных образцов. С помощью ножниц отрежьте лишнюю ручку тампона примерно до половины его длины и поместите тампон в предварительно загруженную микроцентрифужную трубку, чтобы погрузить пенопластовый наконечник в DPBS.
Держа за ручку чистый тампон из пенопласта, предварительно смочите пенопластовый тампон молекулярной водой и стряхните лишнюю воду. Поместите смоченный пенопластовый наконечник на выбранную для наблюдения область и проведите по ней вперед и назад примерно 10 раз, одновременно вращая наконечником тампона по поверхности. С помощью ножниц отрежьте лишнюю ручку тампона примерно до половины его длины и поместите тампон в предварительно загруженную микроцентрифужную трубку, чтобы погрузить пенопластовый наконечник в DPBS, обеспечив полное закрытие крышки.
Выбросьте перчатки и замените их на новые, прежде чем приступать к следующему месту взятия мазка, чтобы свести к минимуму перекрестное загрязнение. Для извлечения тампона поместите микроцентрифужную пробирку в круглый штатив для пробирок и погрузите штатив в водяную баню с чашечным рожком. Убедитесь, что тампон из пенопласта в DPBS внутри трубки находится ниже поверхности воды, оставляя части ручки непогруженными.
Обрабатывайте образец ультразвуком в течение 15 секунд с пятью секундами включения и пятью секундами выключения. После ультразвуковой обработки центрифугируйте пробирку в течение примерно 15 секунд, чтобы собрать DPBS на дне пробирки перед перекачкой. С помощью пипетки P 1000, установленной на 250 микролитров, аккуратно соберите весь экстракт жидкого тампона со дна в соответствующую пустую пробирку с предварительной маркировкой.
Выбросьте использованную трубку с тампоном. Сконцентрируйте образец в вакуумном концентраторе, убедившись, что крышка пробирки открыта, по завершении цикла убедитесь, что образец полностью концентрирован, и в нем остается только гранула. Храните гранулы при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшего использования.
Для анализа ОТ-QuIC готовят отрицательный и положительный планшеты контроля с соответствующими гомогенатами мозга, разведенными в растворе разведения тканей. Теперь разморозьте хранящуюся гранулу экстракта тампона из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия и повторно суспендируйте высушенный экстракт тампона 50 микролитрами молекулярной воды с помощью пипетирования. Кратковременно сделайте вихрь и дайте образцу постоять при комнатной температуре.
Загрузите два микролитра отрицательного и положительного контроля с последующим выделением мазка в соответствующие лунки планшета RT-QuIC. Отрицательные контрольные мазки не превышали порог положительной флуоресценции, что подтверждает отсутствие загрязнения во время процедур. Экстракты положительных контрольных тампонов продемонстрировали равномерный посев во всех реплицированных лунках, демонстрируя надлежащую чувствительность обнаружения.
Образцы поверхностных мазков с незагрязненных участков не показали засеивания выше порогового значения, что подтверждает негативность прионов. На загрязненных прионами поверхностях наблюдался посев выше порогового значения с различными максимальными соотношениями точек и временем флуоресценции по сравнению с контрольной группой. Обработанные отбеливателем поверхности, загрязненные прионами, не засеивали RT-QuIC, демонстрируя эффективную дезинфекцию.
Некоторые поверхностные артефакты демонстрировали измененные кинетические кривые и более длительное время флуоресценции, что указывает на потенциальные ложные срабатывания, вероятно, из-за присутствия пыли или остаточных химических веществ на поверхности.
