Nosso grupo multidisciplinar está tentando entender como uma proteína infecciosa, um príon, pode realizar tarefas biológicas complexas. Também estamos interessados em como os príons podem persistir no meio ambiente por anos a décadas. Após os procedimentos de descontaminação de príons, não estava disponível um método robusto para determinar a eficácia da inativação de príons.
Estamos tentando resolver esse problema com nossa pesquisa. O método de swab, juntamente com o RT-QuIC, permite a amostragem de uma ampla gama de superfícies para detectar atividades de semeadura de príons. Isso pode ser usado para detectar príons associados à superfície em ambientes laboratoriais, clínicos ou ambientais.
Estou interessado em entender como os príons interagem com as superfícies e os requisitos dos príons ligados à superfície para estabelecer a infecção. Para começar, identifique e rotule as áreas de vigilância apropriadas para esfregaço. Prepare dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para cada área identificada e adicione 250 microlitros de DPBS ao primeiro tubo, deixando o segundo vazio.
Recupere os cotonetes com ponta de espuma do armazenamento em uma área livre de contaminação por príons. Preparar os controlos positivos e negativos utilizando homogeneizados cerebrais apropriados ou BH em PPBS. Usando luvas limpas, recupere o número necessário de cotonetes de espuma da embalagem e coloque-os com o lado da alça voltado para baixo em um suporte para tubos.
Garantir que as pontas não entrem em contato com outras superfícies. Segurando um cotonete de espuma limpa pela alça, aplique 50 microlitros das respectivas amostras de controle positivo e negativo nas pontas do cotonete. Usando uma tesoura, corte o excesso de alça do cotonete em aproximadamente metade de seu comprimento e coloque o cotonete no tubo de microcentrífuga pré-carregado para submergir a ponta de espuma no DPBS.
Segurando um cotonete de ponta de espuma limpa pela alça, umedeça previamente a ponta de espuma com água de grau molecular e sacuda o excesso de água. Coloque a ponta de espuma umedecida na área escolhida para vigilância e esfregue a área para frente e para trás aproximadamente 10 vezes enquanto gira simultaneamente a ponta do cotonete na superfície. Usando uma tesoura, corte o excesso de alça do cotonete em aproximadamente metade de seu comprimento e coloque o cotonete no tubo de microcentrífuga pré-carregado para submergir a ponta de espuma em DPBS, garantindo que a tampa possa fechar completamente.
Descarte as luvas e substitua-as por novas antes de prosseguir para o próximo local de coleta para minimizar a contaminação cruzada. Para extração de cotonete, coloque o tubo de microcentrífuga em um rack de tubo circular e mergulhe o rack no banho-maria do sonicador do chifre do copo. Certifique-se de que o cotonete de espuma no DPBS dentro do tubo esteja abaixo da superfície da água, deixando as partes da alça não submersas.
Sonicar a amostra por 15 segundos no total, com cinco segundos de ciclos de ativação e cinco segundos de desativação. Após a sonicação, centrifugue o tubo por aproximadamente 15 segundos para coletar o DPBS na parte inferior do tubo antes da transferência. Usando uma pipeta P 1000 ajustada para 250 microlitros, colete cuidadosamente todo o extrato de swab líquido do fundo para o tubo vazio pré-rotulado correspondente.
Descarte o tubo usado que contém o cotonete. Concentre a amostra em um concentrador a vácuo, garantindo que a tampa do tubo esteja aberta, após a conclusão do ciclo, certifique-se de que a amostra esteja completamente concentrada com apenas um pellet restante. Armazene o pellet a menos 80 graus Celsius até uso posterior.
Para a análise RT-QuIC, preparar uma placa de controlo negativa e positiva com homogeneizados cerebrais correspondentes diluídos em solução de diluição tecidual. Agora descongele o pellet de extrato de swab armazenado do freezer de 80 graus Celsius negativos e ressuspenda o extrato de swab seco com 50 microlitros de água de grau molecular por pipetagem. Vortex brevemente e deixe a amostra descansar em temperatura ambiente.
Carregue dois microlitros de controles de placa negativos e positivos, seguidos de extratos de swab nos respectivos poços de placa RT-QuIC. Os swabs de controle negativo não ultrapassaram o limiar de fluorescência positivo, confirmando que não houve contaminação durante os procedimentos. Os extratos de swab de controle positivo exibiram semeadura consistente em todos os poços replicados, demonstrando sensibilidade de detecção adequada.
As amostras de swab de superfície de áreas não contaminadas não mostraram semeadura acima do limite, confirmando a negatividade do príon. As superfícies contaminadas com príons exibiram semeadura acima do limiar com razões de pontos máximos e tempos de fluorescência variados em comparação com os controles. As superfícies contaminadas com príon tratadas com alvejante não conseguiram semear o RT-QuIC, demonstrando uma desinfecção eficaz.
Alguns artefatos de superfície exibiram curvas cinéticas alteradas e tempos de fluorescência mais longos, indicando potenciais falsos positivos, provavelmente devido à presença de poeira ou produtos químicos residuais em uma superfície.
