Il nostro gruppo multidisciplinare sta cercando di capire come una proteina infettiva, un prione, possa svolgere compiti biologici complessi. Siamo anche interessati a come i prioni possono persistere nell'ambiente per anni o decenni. A seguito delle procedure di decontaminazione con prioni, non era disponibile un metodo robusto per determinare l'efficacia dell'inattivazione dei prioni.
Stiamo cercando di affrontare questo problema con la nostra ricerca. Il metodo del tampone, abbinato a RT-QuIC, consente di campionare un'ampia gamma di superfici per rilevare le attività di semina dei prioni. Questo può essere utilizzato per rilevare i prioni associati alla superficie in ambienti di laboratorio, clinici o ambientali.
Sono interessato a capire come i prioni interagiscono con le superfici e i requisiti dei prioni legati alla superficie per stabilire l'infezione. Per iniziare, identificare ed etichettare le aree di sorveglianza appropriate per il tampone. Preparare due provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri per ogni area identificata e aggiungere 250 microlitri di DPBS alla prima provetta, lasciando vuota la seconda.
Recuperare i tamponi con punta in schiuma dallo stoccaggio in un'area priva di contaminazione da prioni. Preparare i controlli positivi e negativi utilizzando appropriati omogeneizzati cerebrali o BH in DPBS. Utilizzando guanti puliti, prelevare il numero necessario di tamponi di schiuma dalla confezione e posizionarli con il manico rivolto verso il basso in un rack per provette.
Assicurarsi che le punte non entrino in contatto con altre superfici. Tenendo un tampone di schiuma pulito per l'impugnatura, applicare 50 microlitri dei rispettivi campioni di controllo positivi e negativi sulle punte del tampone. Usando le forbici, tagliare il manico in eccesso del tampone a circa metà della sua lunghezza e posizionare il tampone nella provetta da microcentrifuga precaricata per immergere la punta in schiuma in DPBS.
Tenendo un tampone di schiuma pulito per il manico, pre-bagnare la punta di schiuma con acqua di grado molecolare e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso. Posizionare la punta in schiuma inumidita sull'area scelta per la sorveglianza e tamponare l'area avanti e indietro circa 10 volte, ruotando contemporaneamente la punta del tampone sulla superficie. Usando le forbici, tagliare il manico in eccesso del tampone a circa metà della sua lunghezza e posizionare il tampone nella provetta per microcentrifuga precaricata per immergere la punta in schiuma in DPBS, assicurandosi che il coperchio possa chiudersi completamente.
Gettare i guanti e sostituirli con quelli nuovi prima di procedere al sito di tampone successivo per ridurre al minimo la contaminazione incrociata. Per l'estrazione del tampone, posizionare la provetta per microcentrifuga in un rack circolare per provette e immergere il rack nel bagnomaria sonicatore a tromba a coppa. Assicurarsi che il tampone di schiuma nel DPBS all'interno del tubo sia sotto la superficie dell'acqua, lasciando le parti del manico non sommerse.
Sonicare il campione per un totale di 15 secondi con cicli di accensione e cinque secondi di spegnimento. Dopo la sonicazione, centrifugare la provetta per circa 15 secondi per raccogliere il DPBS sul fondo della provetta prima del trasferimento. Utilizzando una pipetta P 1000 impostata su 250 microlitri, raccogliere con cura tutto l'estratto di tampone liquido dal fondo nella corrispondente provetta vuota pre-etichettata.
Gettare la provetta usata contenente il tampone. Concentrare il campione in un concentratore a vuoto, assicurandosi che il tappo della provetta sia aperto, al termine del ciclo, assicurarsi che il campione sia completamente concentrato con solo un pellet rimasto. Conservare il pellet a meno 80 gradi Celsius fino a nuovo utilizzo.
Per l'analisi RT-QuIC, preparare una piastra di controllo negativa e positiva con i corrispondenti omogeneizzati cerebrali diluiti in una soluzione di diluizione tissutale. Ora scongelare il pellet di estratto del tampone conservato dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e risospendere l'estratto di tampone essiccato con 50 microlitri di acqua di grado molecolare mediante pipettaggio. Agitare brevemente e lasciare riposare il campione a temperatura ambiente.
Caricare due microlitri di controlli negativi e positivi su piastra seguiti da estratti di tampone nei rispettivi pozzetti per piastre RT-QuIC. I tamponi di controllo negativi non hanno superato la soglia di fluorescenza positiva, confermando l'assenza di contaminazione durante le procedure. Gli estratti di tampone di controllo positivo hanno mostrato una semina coerente in tutti i pozzetti replicati, dimostrando un'adeguata sensibilità di rilevamento.
I campioni di tamponi superficiali provenienti da aree non contaminate non hanno mostrato una semina superiore alla soglia, confermando la negatività ai prioni. Superfici contaminate da prioni, hanno mostrato una semina al di sopra della soglia con rapporti massimi di punti e tempi di fluorescenza variabili rispetto ai controlli. Le superfici contaminate da prioni trattate con candeggina non sono riuscite a seminare RT-QuIC, dimostrando un'efficace disinfezione.
Alcuni artefatti superficiali mostravano curve cinetiche alterate e tempi di fluorescenza più lunghi, indicando potenziali falsi positivi, probabilmente dovuti alla presenza di polvere o sostanze chimiche residue su una superficie.
