우리의 다학제 그룹은 감염성 단백질인 프리온이 어떻게 복잡한 생물학적 작업을 수행할 수 있는지 이해하려고 노력하고 있습니다. 우리는 또한 프리온이 수년에서 수십 년 동안 환경에서 지속될 수 있는 방법에도 관심이 있습니다. 프리온 오염 제거 절차에 따라 프리온 불활성화의 효능을 결정하기 위한 강력한 방법을 사용할 수 없었습니다.
우리는 연구를 통해 이 문제를 해결하려고 노력하고 있습니다. RT-QuIC와 결합된 면봉 방법을 사용하면 광범위한 표면을 샘플링하여 프리온 파종 활동을 감지할 수 있습니다. 이는 실험실, 임상 또는 환경 환경에서 표면 관련 프리온을 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
저는 프리온이 표면과 어떻게 상호 작용하는지, 그리고 감염을 확립하기 위한 표면 결합 프리온의 요구 사항을 이해하는 데 관심이 있습니다. 시작하려면 면봉을 채취할 적절한 감시 영역을 식별하고 레이블을 지정합니다. 식별된 각 영역에 대해 2개의 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브를 준비하고 첫 번째 튜브에 250마이크로리터의 DPBS를 추가하고 두 번째 튜브는 비워둡니다.
프리온 오염이 없는 장소에 보관하고 있는 거품 면봉을 회수하십시오. DPBS에서 적절한 뇌 균질체 또는 BH를 사용하여 양성 및 음성 대조군을 준비합니다. 깨끗한 장갑을 사용하여 포장에서 필요한 수의 거품 면봉을 꺼내 손잡이 면이 아래로 향하게 하여 튜브 랙에 넣습니다.
팁이 다른 표면에 닿지 않도록 합니다. 깨끗한 거품 면봉을 손잡이에 잡고 각 양성 및 음성 대조군 샘플을 면봉 팁에 50마이크로리터씩 적용합니다. 가위를 사용하여 면봉의 여분의 손잡이를 길이의 약 절반으로 자르고 면봉을 예압된 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 폼 팁을 DPBS에 담그십시오.
깨끗한 폼 팁 면봉을 손잡이로 잡고 폼 팁을 분자 등급의 물로 미리 적시고 여분의 물을 털어냅니다. 감시를 위해 선택한 영역에 적신 폼 팁을 놓고 면봉 팁을 표면에서 동시에 회전시키면서 해당 영역을 앞뒤로 약 10회 면봉으로 닦습니다. 가위를 사용하여 면봉의 여분의 손잡이를 약 절반 길이로 자르고 면봉을 예압된 마이크로 원심분리기 튜브에 넣어 폼 팁을 DPBS에 담그고 뚜껑이 완전히 닫힐 수 있도록 합니다.
교차 오염을 최소화하기 위해 다음 면봉 사이트로 진행하기 전에 장갑을 버리고 새 것으로 교체하십시오. 면봉 추출을 위해 마이크로 원심분리기 튜브를 원형 튜브 랙에 넣고 랙을 컵 혼 소닉테이터 수조에 담그십시오. 튜브 내의 DPBS에 있는 거품 면봉이 물 표면 아래에 있는지 확인하고 손잡이 부분이 물에 잠기지 않도록 합니다.
총 15초 동안 샘플을 초음파 처리하여 5초 동안 켜고 5초 동안 끕니다. 초음파 처리 후 튜브를 약 15초 동안 원심분리하여 이송하기 전에 튜브 바닥에서 DPBS를 수집합니다. 250마이크로리터로 설정된 P 1000 피펫을 사용하여 바닥에서 모든 액체 면봉 추출물을 사전 라벨링된 해당 빈 튜브로 조심스럽게 수집합니다.
면봉이 들어 있는 사용한 튜브를 폐기하십시오. 샘플을 진공 농축기에 농축하고 튜브 캡이 열려 있는지 확인하고, 사이클 완료 시 샘플이 펠릿만 남은 상태로 완전히 농축되었는지 확인합니다. 펠릿을 더 사용할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.
RT-QuIC 분석을 위해 조직 희석 용액에 희석된 해당 뇌 균질액으로 음성 및 양극 플레이트 대조군을 준비합니다. 이제 저장된 면봉 추출물 펠릿을 섭씨 영하 80도의 냉동고에서 해동하고 건조된 면봉 추출물을 피펫팅으로 50마이크로리터의 분자 등급 물로 재현탁합니다. 잠시 Vortex를 사용하고 샘플을 실온에 두십시오.
2마이크로리터의 음극 및 양극 플레이트 컨트롤을 로드한 다음 면봉 추출물을 각각의 RT-QuIC 플레이트 웰에 로드합니다. 음성 대조군 면봉은 양성 형광 임계값을 넘지 않아 시술 중 오염이 없음을 확인했습니다. 양성 대조군 면봉 추출물은 모든 복제 웰에서 일관된 파종을 나타내어 적절한 검출 감도를 보여주었습니다.
오염되지 않은 지역의 표면 면봉 샘플은 임계값 이상의 파종을 보여주지 못하여 프리온 음성이 확인되었습니다. 프리온은 오염된 표면을 대조군과 비교하여 다양한 최대 포인트 비율과 형광 시간으로 임계값 이상의 파종을 나타냈습니다. 표백제로 처리된 프리온으로 오염된 표면은 RT-QuIC를 파종하지 못해 효과적인 소독을 입증했다.
일부 표면 아티팩트는 변경된 운동 곡선과 더 긴 형광 시간을 보였는데, 이는 표면에 먼지나 잔류 화학 물질이 존재하기 때문일 수 있는 잠재적인 거짓 양성을 나타냅니다.
