Fonte: Perchet Thibaut^1,2,3, Meunier Sylvain^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
1 Unidade de Linfopose, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
² INSERM U1223, Paris, França
³ Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
⁴ Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França

A função geral do sistema imunológico é defender o corpo contra organismos infecciosos e outros invasores. Os glóbulos brancos, ou leucócitos, são os principais atores do sistema imunológico. Após a infecção, eles são ativados e iniciam uma resposta imune. Leucócitos podem ser divididos em várias submíopes (por exemplo, células mielóides, linfócitos, células dendríticas) com base em diferentes parâmetros que podem ser biológicos, físicos e/ou funcionais (por exemplo, tamanho, granularidade e secreção). Uma maneira de caracterizar leucócitos é através de suas proteínas superficiais, que são principalmente receptores. Cada população de leucócitos expressa uma combinação específica de receptores (por exemplo, citotóxicos, ativadores, receptores migratórios) que podem definir subconjuntos entre populações. Como o sistema imunológico abrange uma ampla gama de populações celulares, é essencial caracterizá-las para decifrar sua participação na resposta imune.

A citometria de fluxo (FC ou FCM) é um método amplamente utilizado para analisar a expressão da superfície celular e moléculas intracelulares, caracterizando e definindo diferentes tipos de células em uma mistura celular heterogrógena. Os citómetros de fluxo são compostos por três subsetores principais: fluidos, ópticos e eletrônicos. O sistema fluido transporta as células em um córrego de tal forma que elas passam na frente de um laser um por um. O sistema óptico consiste em fontes de luz (lasers) para iluminar as partículas, filtros ópticos para direcionar a luz resultante e sinais fluorescentes para detectores apropriados. Finalmente, o sistema eletrônico converte os sinais de luz detectados em sinais eletrônicos que podem ser processados pelo computador. À medida que uma célula individual passa na frente do raio laser, ela espalha luz. Um detector na frente do feixe mede a dispersão dianteira (FS) e vários detectores para a dispersão lateral da medida lateral (SC). O FS se correlaciona com o tamanho da célula e a SC é proporcional à granularidade das células. Dessa forma, as populações celulares podem muitas vezes ser distinguidas com base em diferenças em seu tamanho e granularidade apenas.

Além de analisar o tamanho, a forma e a complexidade de uma célula, a citometria de fluxo é amplamente utilizada para detectar a expressão dos receptores de superfície celular (1). Isso é feito usando anticorpos monoclonais com rótulo fluorocromático que se ligam a receptores específicos de células conhecidos. Após a excitação, esses fluorochromes ligados emitem uma luz de comprimento de onda específico, chamada comprimento de onda de emissão, que pode ser detectado e pontuado. As medidas de fluorescência fornecem dados quantitativos e qualitativos sobre receptores de superfície celular fluorocromático. Os hematologistas foram os primeiros a utilizar FC para o acompanhamento terapêutico das populações de células imunes (2). Agora, é usado para uma ampla gama de aplicações como imunofenofoteping, viabilidade celular, expressão genética, contagem de células e análise de GFP.

FACS (Fluorescente Activated Cell Sorter) é um tipo especializado de citometria de fluxo, que classifica uma população de células em subpopulação usando rotulagem fluorescente. Assim como a citometria de fluxo convencional, os primeiros dados FS, SC e fluorescentes são coletados. Em seguida, a máquina aplica uma carga (negativa ou positiva) e um sistema de deflexão eletrostática (eletroímãs) facilita a coleta de gotículas carregadas contendo células em tubos apropriados.

Figura 1: Representação esquemática de FACS. A amostra (1) é aspirada no FACS (2) e passada na frente do laser (3). A fluorescência celular é sentida por detectores de fluorescência (4). Finalmente, as células são incorporadas em gotículas e as células de interesse são desviadas por placas de deflexão (5) e coletadas em um tubo de coleta (6). As demais células vão para o lixo (7). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O aspecto de classificação do FACS apresenta muitas vantagens. Muitos testes podem ajudar a entender o papel de células específicas no sistema imunológico, como análises da expressão genética como RT-qPCR, ciclo celular ou secreção de citocinas. No entanto, as células devem ser purificadas rio acima para obter resultados claros e específicos. Aqui, o FACS vem em útil e as células desejadas podem ser classificadas com grande pureza, produzindo resultados altamente confiáveis e reprodutíveis. Facs também pode ser usado para classificar células com base em colorações nucleares ou outras manchas intracelulares e de acordo com a presença, ausência e densidade de receptores superficiais. FACS é agora uma técnica padrão para a purificação de subpopulações de células e tem a capacidade de classificar até quatro populações simultaneamente.

Este exercício de laboratório demonstra como isolar leucócitos esplênicos e, em seguida, como classificar especificamente células linfoides B da mistura de células leucócitos esplênicas usando FACS.