Name: quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00
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Diese Arbeit wurde gefördert von National Science Foundation gewährt IOS-1256565 und IOS-1557638 an AWS. Wir danken Patricia Wittkopp und drei anonymen Rezensenten für ihre hilfreiche Kommentare zu einer früheren Version dieses Artikels.

1. Probenmontage HINWEIS: Tote Fliegen in 70% Ethanol in Wasser vor der Bildgebung. <ol><li> Gießen Sie 10 ml 1,25% Agar in kochendem Wasser in einer 60 mm x 15 mm Petrischale aufgelöst und lassen Sie es einstellen. </li><li> Unter einem Sektionsmikroskop verwenden Sie ein Paar Feinpinzetten, um eine ~ 20 mm ong, 2 mm breite, 1 mm tiefe Rille in der Oberfläche des Gels zu machen. Mit feinen Zangen, eingebettet die ventrale Seite einer erwachsenen Fliege in die Nut, wobei die dorsale Sei...

Diese Methodik ermöglicht die präzise, ​​schnelle und wiederholbare Erfassung von Pigmentierungsdaten in quantitativer Form, die für mehrere nachgeschaltete Analysen geeignet ist. Die Methode wurde verwendet, um Daten über die Wirkung der Temperatur auf die Bauchpigmentierung in einer isogenen Linie von Fliegen zu erwerben. Allerdings könnte die Methodik in Forward-Genetics-Studien verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die den Pigmentierungsunterschieden zwischen Individuen, Populationen oder Spezies zug...

Die Pigmentierung zeigt eine enorme phänotypische Variation zwischen Arten, Populationen und Individuen und sogar innerhalb von Individuen während der Ontogenese 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Obwohl es in einer Vielzahl von Tieren unzählige Pigmenttests gibt, ist die Pigmentierung am besten in Drosophila melanogaster untersucht worden , wo die volle Kraft der Molekulargenetik verwendet wurde, um die Entwicklungs- und physiologischen Mechanismen zu erforschen, die die Pigmentierung regulieren und wie sich diese Mechanismen entwickeln 1 , 6 Es ist viel über die Gene bekannt, die die biochemische Synthese von Pigmenten in D. melanogaster 7 , 8 und den Genen, die das zeitliche und räumliche di kontrollieren, regulierenVerteilung dieser Biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Darüber hinaus hat die genetische Kartierung die genetischen Loci identifiziert, die intra- und interspezifischen Unterschiede in der Pigmentierung in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 liegen . Auch die Beziehungen zwischen Pigmentierung und pleiotropen Merkmalen wie Verhalten 18 , 19 und Immunität 19 , 20 wurden ebenso erforscht wie die adaptive Bedeutung der Pigmentierungsmuster 15 , 21 , 22 . Als solches ist die Pigmentierung in D. melanogaster als eine mächtige und dennoch einfache m aufgetauchtOdel für die Entwicklung und Entwicklung von komplexen Phänotypen. Pigmentierung im erwachsenen D. melanogaster zeichnet sich durch deutliche Melanisierungsmuster über den Körper, besonders an den Flügeln und dem dorsalen Thorax und Bauch. Es ist die Pigmentierung jeder cuticular Platte (tergite) auf dem dorsalen Abdomen, jedoch, die die meisten Forschung Aufmerksamkeit erhalten hat. Es gibt eine beträchtliche Variation in dieser Pigmentierung (Abbildung 1A- F ), weil sowohl genetische 17 , 23 und Umwelt 24 , 25 Faktoren. Die Nagelhaut eines abdominalen Tergits besteht aus vorderen und hinteren Entwicklungsfächern (Abbildung 1G ), die jeweils je nach Pigmentierung und Ornamentierung weiter unterteilt werden können. Das vordere Fach umfasst sechs NagelhautTypen (a1-a6), und das hintere Kompartiment enthält drei (p1-p3) (Abbildung 1G ). Von diesen werden die p1, p2 und a1 Nagelhaut typischerweise unter dem Tergit in ungedehnten Abdomen gefaltet, so dass sie verborgen sind. Die zuverlässig sichtbare Nagelhaut zeichnet sich durch eine Bande von schwerer Pigmentierung aus, die hier als &quot;Pigmentband&quot; bezeichnet wird und aus Nagelhauttypen a4 (haarig mit mäßigen Borsten) und a5 (behaart mit großen Borsten) mit dem hinteren Rand des Bandes besteht Intensiver pigmentiert als die vordere Kante (Abbildung 1G ). Anterior zu dieser Band ist eine Region von leicht pigmentierten behaarten Nagelhaut, die Borsten nach hinten (a3) ​​aber nicht anteriorly (a2) hat. Eine Variation der Pigmentierung zwischen Fliegen wird sowohl in der Intensität der Pigmentierung als auch in der Breite des Pigmentbandes beobachtet. Im Allgemeinen ist die Variation am stärksten in den hintersten Segmenten (Bauchsegmente 5, 6 und 7) und ist in den anterioren Segmenten niedriger (abdominal seGionen 3 und 4) 24 . Darüber hinaus gibt es einen sexuellen Dimorphismus in D. melanogaster Pigmentierung, wobei Männer im Allgemeinen vollständig pigmentierte fünfte und sechste Bauch-Tergite (Abbildung 4C ) haben. In den meisten Untersuchungen der Bauchpigmentierung in D. melanogaster wurde die Pigmentierung als kategorisches oder ordinales Merkmal behandelt, wobei das Muster qualitativ 27 , 28 , 29 oder halbquantitativ auf einer Skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 gemessen wurde , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Diese Methoden leiden unweigerlich an einem Mangel an Präzision, und weil sie sich auf die subjektive Bewertung der Pigmentierung verlassen, ist es schwierig, die Daten über Studien zu vergleichen. Mehrere Autoren haben die räumlichen Dimensionen der Pigmentierung 38 , 39 , die Intensität der Pigmentierung eines bestimmten Häutchen Typ 23 , 25 , 39 , 40 oder die durchschnittliche Intensität der Pigmentierung über die Bauch-Tergit als Ganzes 41 , 42 , 43 quantifiziert. Dennoch messen diese Quantifizierungsmethoden nicht sowohl die Intensität als auch die räumliche Verteilung der Bauchpigmentierung gleichzeitig und erfassen daher nicht die Nuancen, wie sich die Pigmentierung über den Abd unterscheidetOminal tergite Weiterhin erfordern mehrere dieser Quantifizierungsverfahren 38 , 41 , 42 , 43 die Dissektion und Montage der Bauchhöhle. Dies ist sowohl zeitaufwändig als auch zerstört die Probe, so dass es für weitere morphologische Analysen nicht verfügbar ist. Als das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung der Bauchpigmentierung vertieft, werden anspruchsvollere Werkzeuge zur schnellen und präzisen Messung sowohl der räumlichen Verteilung als auch der Intensität der Pigmentierung erforderlich sein. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die digitale Bildanalyse zu nutzen, um eine replizierbare und präzisere Messung der Bauchpigmentierung in D. melanogaster zu erhalten . Die Methodik umfasst drei Stufen. Zuerst wird die erwachsene Fliege zerstörungsfrei montiert und ein digitales Bild des dorsalen Bauches genommen. Zweitens, mit einem ImageJ-Makro, der BenutzerDefiniert einen anterior-posterioren Streifen von Pixeln, der sich von der vorderen Seite der a2-Nagelhaut bis zum hinteren der a5-Nagelhaut (grüner Kasten, Abbildung 1G ) auf dem dritten und vierten Bauchsegment erstreckt. Der mittlere Pixelwert über die Breite dieses Streifens wird dann entlang seiner langen Achse extrahiert, wodurch ein Profil erzeugt wird, das die räumliche Verteilung und die Intensität der Pigmentierung einfängt, wenn es sich von der vorderen zur hinteren des Tergits ändert. Drittens wird ein R-Skript verwendet, um das Pigmentprofil mathematisch mit einem kubischen Spline zu beschreiben. Das R-Skript verwendet dann das Spline und seine erste und zweite Ableitung, um die Breite der a2-a5-Nagelhaut, die Breite des Pigmentbandes und die maximale und minimale Pigmentierung zu extrahieren. Die Methode quantifiziert daher sowohl die räumlichen Eigenschaften als auch die Tiefe der Bauchpigmentierung. Diese Methodik quantifiziert die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite,Die im Fokus zahlreicher früherer Studien 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 waren , entweder ausschließlich oder in Kombination mit mehr posterioren Tergiten. Obwohl weniger variabel als die fünfte und sechste Bauch-Tergite, die dritte und vierte Tergite sind nicht vollständig pigmentiert bei Männern, so dass dieses Protokoll kann sowohl für Männer und Frauen angewendet werden. Dennoch kann, wie hier gezeigt, das Protokoll verwendet werden, um die Pigmentierung in der fünften und sechsten Bauch-Tergite bei Frauen zu messen. Darüber hinaus sollten kleinere Modifikationen der Skripte, die verwendet werden, um die Eigenschaften des Pigmentierungsprofils zu extrahieren, das Verfahren zur Quantifizierung der Variation der Pigmentierung in einer Vielzahl von anderen verwendenOrganismen

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Biology Forceps</td>
			<td>FST</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MDG41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gooseneck Cold Light Source</td>
			<td>Schott</td>
			<td>ACE 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Control Software</td>
			<td>Micro-Manager v1.3.20</td>
			<td></td>
			<td>https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>R 3.3.2</td>
			<td></td>
			<td>https://www.r-project.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>LEDWE-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimeter</td>
			<td>Fluke</td>
			<td>Fluke 75 Series II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15 mm Petri dish</td>
			<td>Celltreat Scientific Products</td>
			<td>229663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage micrometer</td>
			<td>Klarman Rulings, Inc.</td>
			<td>KR-867</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying abdominal pigmentation in drosophila melanogaster

Pigmentierung ist ein morphologisch einfaches, aber sehr variables Merkmal, das oft anpassungsfähige Bedeutung hat. Es hat vielmehr als Modell für das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung von morphologischen Phänotypen gedient. Die Bauchpigmentierung in Drosophila melanogaster war besonders nützlich, so dass Forscher die Locus identifizieren können, die inter- und intraspezifischen Variationen in der Morphologie zugrunde liegen. Bisher wurde jedoch die D. melanogaster- Bauchpigmentierung weitgehend qualitativ durch Scoring statt quantitativ untersucht, was die Formen der statistischen Analyse begrenzt, die auf Pigmentationsdaten angewendet werden können. Diese Arbeit beschreibt eine neue Methodik, die die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Bauchpigmentierungsmusters des erwachsenen D. melanogaster ermöglicht . Das Protokoll umfasst Probenmontage, Bildaufnahme, Datenextraktion und Analyse. Die gesamte Software, die für die Bildaufnahme und Analyse verwendet wird, verfügt über MakrosGeschrieben für Open-Source-Bildanalyse. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, Pigmentierungsmerkmale präzise zu messen, wobei eine Methodik verwendet wird, die über verschiedene Abbildungssysteme hoch reproduzierbar ist. Während die Technik verwendet wurde, um die Variation in den tergischen Pigmentierungsmustern des erwachsenen D. melanogaster zu messen , ist die Methodik flexibel und breit auf Pigmentierungsmuster in unzähligen verschiedenen Organismen anwendbar.

Das Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Aufzuchttemperatur auf die Bauchpigmentierung zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Entwicklungstemperatur zu einer Verringerung der Ausbreitung der Bauchpigmentierung bei mehreren Arten von Drosophila führt , einschließlich D. melanogaster 30 , 32 . Speziell bei den Bauch-Tergiten 3 und 4 nimmt das Ausmaß der Pigmentierung (B...

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Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Quantifizierung der Bauchpigmentierung in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

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