Name: ganglioside extraction, purification and profiling
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00
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この研究は、米国国立衛生研究所(NIH)の共通基金(Common Fund for Glycoscience)助成金U01CA241953の支援を受けた。MJPは、ジョンズ・ホプキンス大学の化学-生物学界面プログラム(T32GM080189)の支援を受けた。

組織採取は、ジョンズ・ホプキンス動物ケア・使用委員会によって承認された条件下で行った。
1. 小規模ガングリオシド抽出と部分精製
警告: 揮発性および有毒な溶剤を使用する場合は、適切な換気を行ってください。全体にプラスチックを避けます;溶剤は、その後の分析を妨げる多くのプラスチックから化学成分を抽出します。ポリテトラフルオ?...

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	<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biology+of+Gangliosides.">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li><li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces.">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system.">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li><li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+die+Ganglioside,+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+[About+gangliosides,+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids].">&#220;ber die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift f&#252;r Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li><li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+machinery+of+GM4:+the+excess+amounts+of+GM3/GM4S+synthase+(ST3GAL5)+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells.">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li><li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-selectin+receptors+on+human+leukocytes.">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li><li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain:+its+structure+and+stage-specific+expression.">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li><li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion,+motility,+and+growth,+through+glycosynaptic+microdomains.">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li><li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b.">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li><li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy.">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li><li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans.">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+glycosphingolipids.">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li><li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides.">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li><li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+procedure+for+the+extraction,+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides.">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li><li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures.">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li><li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids.">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li><li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gangliosides:+structure,+isolation,+and+analysis.">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li><li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance.">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li></ol>

ここで報告された小規模および大規模のガングリオシドの抽出および単離の方法は、独自のものではなく、優れた結果を提供する多くの異なる溶媒抽出および精製アプローチがあります12。FredmanとSvennerholm13からの脳からの小規模精製のためにここで報告された方法は、回復を最適化することが示され、私たちの研究室で長年にわたって堅牢で簡単であるこ...

ガングリオシドは、1つ以上のシアル酸残基を有するスフィンゴ糖脂質1として定義される。それらは主に細胞表面で発現し、その疎水性セラミド脂質部分は原形質膜の外小葉に埋め込まれ、親水性グリカンは細胞外空間に広がっています2。脊椎動物の細胞や組織に広く分布していますが、脊椎動物の脳3に特に豊富に存在しており、そこで最初に発見され命名されました4。
ガングリオシドグリカンの構造はさまざまで、その命名法の基礎となっている(図1)。ガングリオシドグリカンは、シアル酸の異なる数および分布を有する中性糖コアからなる。最小のガングリオシドであるGM4は、2つの糖(ガラクトースに結合したシアル酸)のみを有する5。より大きな天然に存在するガングリオシドは、単一の中性コア上に1ダース以上の総糖6 または最大7つのシアル酸を含むことができる7。それらのセラミド脂質部分も変化し、異なるスフィンゴシン長および様々な脂肪酸アミドを有する。脊椎動物の脳では、4つのガングリオシド種、GM1、GD1a、GD1b、およびGT1bが優勢である。ガングリオシド発現は、発生的に調節され、組織特異的であり、かつ細胞型特異的である。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg"> 図1:主要な脳ガングリオシドおよびその生合成前駆体。 構造は、グリカン11のシンボル命名法を用いて示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ガングリオシドは、自身の膜にタンパク質を関与させ調節することによって(シス調節)、または他の細胞上の細菌毒素およびレクチンを含む細胞外環境におけるグリカン結合タンパク質を関与させること(トランス認識)によって分子レベルで機能する3。ガングリオシドの調節タンパク質への特異的結合および/または他の分子との脂質ラフトへの自己会合は、神経系の構造および機能、癌の進行、代謝、炎症、神経細胞タンパク質障害、および感染症に影響を与える細胞挙動の変化をもたらす8。それらの多様な細胞の役割のために、それらの単離および分析のための方法は、生理学的および病理学的プロセスの調節に関する強化された洞察を提供することができる。ここでは、迅速な小規模抽出および分析のための検証された方法、および脳からのガングリオシドの分取スケール単離が提供される。他の組織への適用のための機会と課題が議論される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bovine brain, stripped</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>57105-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ganglioside standards</td>
			<td>Matreya</td>
			<td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottle with PTFE-lined cap</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-911-739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass centrifuge bottle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-586B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass culture tubes, 16 x 125 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60825-430</td>
			<td>for collecting HPLC fractions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass separatory funnel (2 L)</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>6400-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-Anisaldehyde, 98%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;A88107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potter-Elvhjem Homogenizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-414-14A</td>
			<td>Choose appropriate volume option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprosil 100 NH2 10&#181;m 5x4mm guard columns</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>AAVRS1N-100540-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reprospher 100 NH2, 5 &#956;m, 250 mm x 20 mm HPLC column</td>
			<td>Analytics-Shop</td>
			<td>custom packed</td>
			<td>other sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resorcinol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30752-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>R-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>57632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT043350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg</td>
			<td>Waters</td>
			<td>WAT036810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spotting syringe - Hamilton 701N 10 &#181;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-933A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-323</td>
			<td>For ganglioside storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M1056350001</td>
			<td>Fluorescence impregnation (F254) stabilizes the sorbent surface</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC reagent sprayer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-723-26A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC running chamber for 10 x 10 cm plates</td>
			<td>Camag</td>
			<td>22.5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender</td>
			<td>Waring</td>
			<td>E8520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ganglioside extraction, purification and profiling

ガングリオシドは、1つ以上のシアル酸残基を含むスフィンゴ糖脂質である。それらはすべての脊椎動物の細胞および組織に見られるが、脳に特に豊富に存在する。主に細胞の原形質膜の外側小葉に発現し、横方向の会合を介して細胞表面タンパク質の活性を調節し、細胞間相互作用における受容体として作用し、病原体および毒素の標的である。ヒトにおけるガングリオシド生合成の遺伝的調節不全は、重度の先天性神経系障害をもたらす。ガングリオシドの両親媒性の性質上、ガングリオシドの抽出、精製、および分析には、発見以来80年間に多くの研究者によって最適化された技術が必要です。ここでは、数時間で完了できる組織および細胞からの主要なガングリオシドの抽出、精製、および予備的な定性的および定量的分析のためのベンチレベルの方法について説明する。我々はまた、脳からの主要なガングリオシド種のより大きなスケールの単離および精製のための方法を記述する。一緒に、これらの方法は、生理活性分子のこのクラスへの分析的および分取スケールアクセスを提供します。

セクション1(小規模)に記載された方法は、主要な脳ガングリオシドの定性的および定量的決定に十分な量および純度でガングリオシドを提供する。マウス脳からの回収率は、記載されたように調製した場合、脳湿重量gあたり〜1μmolガングリオシド(1nmol/μL)である。セクション3を用いた1 μL(1 nmol)のTLC分解能は、レゾルシノール検出のための十分な材料を提供し、 図4に野...

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Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

ガングリオシドは、シアル酸を含むスフィンゴ糖脂質であり、脳内に特に豊富に存在する。それらの両親媒性の性質は、最適な回収と正確な分析を確実にするために有機/水性抽出および精製技術を必要とする。この記事では、分析および分取スケールのガングリオシドの抽出、精製、および薄層クロマトグラフィー分析の概要を提供します。

ガングリオシドの抽出、精製、プロファイリング

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

ガングリオシドは、すべての脊椎動物の細胞表面に発現しており、神経細胞に特に豊富に存在する。それらは細胞シグナル伝達および細胞 - 細胞認識を調節する。このプロトコルは、ガングリオシドの単離および分析を導入する。この技術は、精製を合理化しながら、大小のスケールでガングリオシド収率を最大化するために選択された。また、ガングリオシド分析を比較的迅速に行う方法も説明します。脂質、特にガングリオシドのような極性脂質に関する研究は、タンパク質や核酸を扱うのとは異なるツールや技術を必要とします。このビデオでは、これらの分子を操作する方法に慣れ親しんでいます。クロロホルムやテトラヒドロフランなどの溶媒は一般的なプラスチックを溶解するため、これらの手順では、テフロン(登録商標)ライニングキャップ、ガラスピペット、ガラス、ステンレス製マイクロシリンジ、テフロン(登録商標)ガラスホモジナイザーを備えたガラス瓶およびバイアルを使用する。これを怠ると、製品中のプラスチックポリマーが分析を妨げる可能性があります。まず、組織湿重量1グラムあたり4.1ミリリットルの水を加え、10ストロークで均質化します。組織1グラムあたり13ミリリットルのメタノールを加える。それを摂氏22度の周囲温度に移し、混合する。PTFEライニングスクリューキャップを備えた厚肉のガラス製スクリューキャップ付きチューブに組織を移し、徹底的に混合します。組織1グラムあたり6.5ミリリットルのクロロホルムを加え、蓋をし、徹底的に混ぜる。450倍gで15分間遠心分離する。次いで、透明な上清を新鮮なスクリューキャップ付きチューブに移し、その体積を回収抽出量として測定する。分配のために、回収された抽出量の水の0.173倍を透明な上清に加える。それからそれをキャップします。渦が勢いよく。450倍gで15分間遠心分離する。ガングリオシドを含む上部相を、PTFEライニングスクリューキャップを備えた新鮮なガラス管に移す。逆相カートリッジクロマトグラフィーを行うには、5 ミリリットルのガラスシリンジを使用して、tC18 固相抽出カートリッジを 3 ミリリットルのメタノールで洗浄します。次に、クロロホルム - メタノール - 水を2対43〜55の割合で3ミリリットル加える。前のステップの上相を同じガラスシリンジを通してtC18カートリッジにロードします。フロースルーを収集し、カラムにリロードして吸着を最適化します。カートリッジを3ミリリットルのクロロホルム - メタノール - 水で洗浄し、次に3ミリリットルのメタノール - 水で洗浄する。ガングリオシドを3ミリリットルのメタノールで溶かし、新鮮なスクリューキャップ付きチューブに入れます。摂氏45度以下の温度で窒素の穏やかな流れの下で蒸発乾固させる。元の組織湿重量のグラムあたり1ミリリットルでメタノールに溶解する。100グラムの脳灰白質をブレンダーに入れ、pH6.8の冷却された10ミリモルのリン酸カリウム緩衝液の脳湿重量あたり1ミリリットルを加える。その後、ローで20秒間均質化します。脳湿重量1グラムあたり8ミリリットルのテトラヒドロフランを加え、10秒間ローで均質化する。ガラス製遠心分離機ボトルにデカントし、5,000倍gで15分間遠心分離した。上清を集め、その体積を測定し、ガラスの分液漏斗に移します。上清1ミリリットル当たり0.3ミリリットルのエチルエーテルを加える。激しく振る。その後、30分間邪魔されずに座らせ、その間に2つの相、上部エーテル相および下部水相が分離する。ガングリオシドを含む下相をPTFEライニングキャップ付きのガラス瓶に集める。分液ロートに残っている上部エーテル相に、前のステップからの元の上清1ミリリットルあたり0.1ミリリットルの水を加える。激しく振る。フェーズの分離を許可します。次に、下部水相を収集し、以前に収集した下部相と組み合わせる。結合された下部相を乾燥粉末に蒸発させ、それを計量する。逆相クロマトグラフィーを行うには、真空または圧力を使用してカラムに 50 ミリリットルの溶媒を通し、洗浄につき 1 分未満で 50 ミリリットルの溶媒を通過させることにより、大規模な tC18 固相抽出カートリッジを予備洗浄します。ケン化後の相分離から上相を真空または圧力でカラムにロードします。次に、フロースルーを収集してリロードし、後続の解析のためにフロースルーを再度収集します。カラムをクロロホルム - メタノール - 水の各30ミリリットルで洗浄し、続いてメタノール - 水で洗浄する。次いで、ガングリオシドを50ミリリットルのメタノールで溶出し、次いで再び10ミリリットルのメタノールで溶出する。各洗浄液と溶出液を別々に集める。薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用して、ガングリオシドがフロースルーおよび洗浄から存在せず、メタノールの最初の溶出で溶出することを確認します。溶出したガングリオシドを乾燥粉末に蒸発させ、それらを計量する。TLCを実行するには、溶剤の深さが0.5センチメートルになるように、ステンレス製のカバーを備えた10×10センチメートルのガラスTLCチャンバーに、ランニング溶剤を注ぎます。チャンバーを覆い、約10分間平衡化させます。10マイクロリットルのハミルトンシリンジをメタノールを使用して斜めの針で洗う。1マイクロリットルのメタノールをガラスシリンジに引き込んで針のデッドボリュームを満たし、次に1マイクロリットルのサンプルまたは標準液を満たします。シリンジにメタノール溶媒が1マイクロリットル未満になるまで、サンプルを5ミリメートルの所定のマークされた線に均等に配置します。すべてのサンプルが見つかったら、プレートを摂氏 22 度で乾燥させます。点着および乾燥プレートを、底端をランニング溶媒に浸漬した予め平衡化されたTLCチャンバー上に置く。溶媒前部がプレートの上部から1センチメートル以内に達するまで、実行中の溶媒が毛細管現象によってプレートを上方に前進させる。プレートの端にある溶剤の前面を取り除き、鉛筆で印を付けます。溶媒が邪魔されずに、または穏やかな空気の流れの下で完全に蒸発するのを許してください。化学ヒュームフードに、分解されたガングリオシドの起源を持つTLCプレートを逆さまにして、フードの壁を酸スプレーから保護するために、切り取られた段ボール箱に入れます。レゾルシノールスプレー試薬をガラスTLC噴霧器に入れる。加圧窒素源に取り付け、プレートを縦横方向に斜めに軽くスプレーします。すぐに同じ寸法の清潔で乾燥したガラスカバープレートでプレートを覆い、バインダークリップでカバープレートを所定の位置に固定します。蓋をしたプレートを摂氏125度で20分間加熱します。ガングリオシドは白い背景に対して濃い紫色に見えます。脂質染色を行うには、分解されたガングリオシド起源のTLCプレートをアニスアルデヒド染色を含むビーカーに浸漬する。ランニングフロントに2秒強沈めます。それからそれを排水するのを許しなさい。ホットプレート上のTLCプレートを低温で加熱し、現像する。このプロトコルは、定性的および定量的測定に十分な量および純度でガングリオシドを提供する。1マイクロリットルのTLC分解能は、レゾルシノール検出のための十分な材料を提供し、野生型および遺伝子改変マウスの主要な脳ガングリオシドをすべて解決する。調製された混合ガングリオシドは他の主要な脂質を含まないが、それらは、陰性モードでの天然精製ガングリオシドとして、または陽性様式におけるプレメチル化後のいずれかの質量分析決定に十分な純度を有する。大規模な精製には、抽出、ケン化、およびHPLC分解能が含まれ、生物学的実験およびさらなる化学的および酵素的修飾に適した精製された主要な脳ガングリオシドを提供する。例示的なHPLCプロファイルおよびその後のTLC分析が示されている。アルカリ処理、またはケン化は、汚染リン脂質を加水分解および除去するために必要であるが、O-アセチル化シアル酸などのガングリオシドの天然修飾も加水分解するものであり、これはいくつかの文脈において重要であり得る。抽出、溶媒分配、TLC 分解能の正確な溶媒比は、回収率、純度、および分析を強化するために不可欠です。がんから代謝、脳機能まで、ガングリオシドは生理学的調節剤および治療標的である。ガングリオシドの単離、精製、および分析は、生物医学的発見および治療開発の礎石です。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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ハイスループットプリマゼプロファイリングを用いたDNAプリマゼによるDNA配列認識

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...