Hittil har CRISPR bare blitt brukt i en håndfull Hemipterans. Protokollen som er skissert her, kan hjelpe forskere med å anvende CRISPR og germline-transformasjon i andre Hemipteran-arter. Denne protokollen ble utviklet spesielt for insektembryoer som er følsomme for uttørking.
Mange trinn i protokollen kan potensielt forbedre resultatene i andre insektarter. Evnen til å generere transgene plantehoppere åpner døren for nye kontrollmetoder, for eksempel å skape insekter som ikke lenger kan overføre virus. Denne teknikken vil være revolusjonerende for å studere genfunksjon i andre, for eksempel de vestlige blomstertripsene.
Vi har tilpasset denne CRISPR-teknikken for tripsembryoer med lovende resultater. Vi finner at praksis i dette systemet er avgjørende for å lykkes. Metodene som vises her, når de utføres rutinemessig, bør tillate fleksibel bruk i en rekke innstillinger.
For å lage et kammer for å holde de voksne Peregrinus maidis-insektene, kutt et hull i bunnen av en unse kopp og lim en skjerm over hullet for luftutveksling. For valg av en uke gamle voksne kvinnelige insekter, aspirer kolonien inn i et 15 milliliter konisk rør i en time, før du kort kjøler insekter på is. Identifiser hunnene ved tilstedeværelsen av ovipositoren, som vanligvis er mørkere enn resten av magen, på den ventrale siden av magen.
Overfør hunnene i koppen etter hvert som de samles inn. Når 15 kvinner er valgt, forsegl koppen med et fem ganger fem centimeter stykke parafinvoksfilm. Påfør 400 mikroliter av en 10% sukroseoppløsning på toppen av filmen, og legg et andre fem til fem centimeter stykke film over løsningen.
Legg det voksne kammeret på et eggoppsamlingsfat med parafinvoksfilmsiden av plast i direkte kontakt med oviposisjonsmediet, og pakk hele eggleggingskammeret med plastfolie uten å dekke lufthullene. Plasser deretter kammeret på 25 grader Celsius med 70% fuktighet og 14 timers lys, 10 timers mørk syklus. For embryooppsamling, etter ønsket eggleggingsperiode, påfør en til 15 millimeter stripe dobbeltsidig tape på en 22 x 30 millimeter dekselslipp og legg dekselglidningen på oviposisjonsmediet til eggleggingskammeret.
Bruk en fin børste og et dissekerende mikroskop, flytt individuelle halvtransparente embryoer fra agaroverflaten til dobbeltsidig tape. Når omtrent 25 embryoer er valgt, ordne de bananformede embryoene på sidene med de større endene fast på båndet. For mikroinjeksjon av embryoene, legg først dekselet på en 100 x 15 milliliter petriskål flush med 1% agar under et dissekerende mikroskop inne i en fuktet hette.
For å kontrollere injeksjonstrykket, plasser spissen av en kanyle for kvartsinjeksjon i en dråpe vann og start injeksjonssyklusen. Etter å ha bekreftet trykkinnstillingen, nærmer seg fra venstre side av dekselet, sett nålen inn i den større enden av ett embryo. Lever injeksjonsoppløsningen inn i egget og trekk raskt ut nålen.
Når alle eggene er injisert, legg dekselet på overflaten av en ny 1% agar tallerken og legg fatet i et fuktighetskammer. Etter seks dager, bruk rent vann og fin børste for å overføre eventuelle overlevende embryoer til en 35 x 10 millimeter petriskål som inneholder vannfuktet filterpapir. Forsegl petriskålen med parafinvoksfilm av plast og plasser klekkekammeret i en 25 graders Celsius-inkubator.
Etter seks til åtte dager, bruk en fin børste for å overføre eventuelle fremvoksende første stjernenymfer til en petriskål med bladklipp og forsegle parabolen med parafinvoksfilm av plast. Etter 48 timer ved 25 grader Celsius, bruk en fin børste for å overføre alle de to dager gamle nymfene til et oppdrettsbur med maisplanter. Hvis injektører med synlig fenotype gjenvinnes i tilstrekkelig antall, bur disse insektene separat for å maksimere utvinningen av målegenskapen i neste generasjon.
Oppdra insektene under passende temperatur- og fuktighetsforhold med regelmessige overføringer til ferske maisplanter etter behov, og screene avkommet regelmessig for forventede fenotyper, og plasser individer som viser ønsket fenotype i sine egne bur for å etablere homozygote linjer. I denne representative analysen ble totalt 6.483 egg samlet fra totalt 645 kvinner om fire uker. Hunnene begynner vanligvis å legge egg etter to dager og gir de fleste eggene fra dag fire til seks, med oviposisjonsaktiviteten som avtar etter dag ni.
Cas9 ni injeksjoner påvirker ikke P.maidis utvikling, da utviklingsratene for embryoer behandlet med injeksjonsbuffer, injeksjonsbuffer supplert med Cas9 og injeksjonsbuffer supplert med Cas9 og tre guide-RNA, er lik. Lukehastighetene for buffer- og Cas9-kontrollene er også like. Imidlertid er klekkefrekvensen til individer som mottar treveisblandingen vanligvis relativt lavere.
I dette representative eksperimentet, av de 71 guide-injiserte individer som utviklet, viste 23 en viss grad av pigmenttap og ni klekket, noe som resulterte i en knockout-rate på ca. 30%Den tre-guide-blandingen forventes å fjerne ca. 180 basepar fra det hvite locus, som observert i PCR-produktene amplifisert fra genomisk DNA isolert fra injiserte individer, samt i de tilknyttede sekvensdataene generert fra disse produktene. Vi anbefaler bruk av skrå nåler for å minimere injeksjonstraumer. Hvis embryoene ser ut til å lekke etter injeksjonen, undersøk nålespissene for bedre resultater.
Fortsatt praksis vil øke embryooverlevelsen. Til dags dato er det ingen publikasjoner som beskriver kimlinjetransformasjon i Hemipterans. Vi har imidlertid brukt denne protokollen til å lage Cas9-uttrykkende plantehoppere.
Samlet sett åpner evnen til å utføre germline-transformasjon i Hemipterans døren til et bredt spekter av genetiske skadedyrshåndteringsstrategier, og reduserer dermed bruken av insektmidler.
