تنقية الميتوكوندريا من خلايا الخميرة

Summary

نحن تصف طريقة سريعة وفعالة لتنقية الميتوكوندريا من الخميرة السكيراء الجعوية. هذه الطريقة تمكن من عزل عالية الغلة من الميتوكوندريا نقية خالية من التلوث أساسا العضيات الأخرى والمحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية الخاصة بهم بعد تنقيتها.

Abstract

الميتوكوندريا هي الموقع الرئيسي لإنتاج ATP أثناء عملية التمثيل الغذائي في الخلايا الهوائية غير حقيقية النواة الضوئي

Protocol

المواد والأساليب

سلالات الخميرة وظروف النمو

كانت تزرع سلالة من النوع البري BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) في المتوسط ​​YEPD الغنية (1 ٪ خلاصة الخميرة ، ببتون 2 ٪ ، السكر بنسبة 2 ٪). والخلايا المستزرعة في 30 درجة مئوية مع الهز التناوب في 200 دورة في الدقيقة في قوارير مخروطي في نسبة "قارورة حجم / متوسطة الحجم" ل05:01.

كسر عزلة الميتوكوندريا الخام

1. 1 لتر تنمو ثقافة BY4742 سلالة من النوع البري لمدة 48 ساعة.
2. من أجل ثقافة في 500 مل من أنابيب الطرد المركزي Nalgene. تحقيق التوازن في تحميل وحصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
3. صب مكعبات الخلايا وطاف resuspend في 250 مل من dH2O. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
4. صب مكعبات الخلايا وطاف resuspend في 250 مل من dH2O. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
5. تحديد الوزن الرطب للبيليه الخلية.
6. Resuspend الخلايا في مكعبات العازلة DTT [2 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز].
7. تعليق نقل الخلية إلى 50 مل أنابيب بلاستيكية من طراز فالكون.
8. تدوير أنابيب في 70 دورة في الدقيقة في شاكر لمدة 20 دقيقة حتى 30 درجة مئوية.
9. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
10. Resuspend الخلايا في مكعبات العازلة Zymolyase دون [7 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز] Zymolyase.
11. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في درجة حرارة الغرفة.
12. Resuspend الخلايا في مكعبات العازلة Zymolyase دون [7 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز] Zymolyase.
13. تعليق نقل الخلية إلى قارورة زجاجية.
14. إضافة مسحوق Zymolyase - 100T [1 ملغ من الخلايا (الوزن الرطب) Zymolyase - 100T / ز] إلى تعليق الخلية.
15. تدوير القارورة مع تعليق خلية في الدقيقة 70 في شاكر لمدة 30 دقيقة حتى 30 درجة مئوية.
16. شكلت spheroplasts نقل نظرا لهضم جدار الخلية مع Zymolyase - 100T إلى 50 ميلي أنابيب الطرد المركزي من البلاستيك.
17. بيليه spheroplasts بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في XG 2200 في 4 درجات مئوية.

وينبغي القيام ** جميع الخطوات اللاحقة بها في 4 درجات مئوية أو على الجليد. وينبغي التعامل مع تعليق من spheroplasts بلطف باستخدام ماصات مع نصائح لتجنب خفض كسر العضيات **.

18. Resuspend spheroplasts مكعبات الثلج في تجانس العازلة الباردة [6.5 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز].
19. بيليه spheroplasts بواسطة الطرد المركزي لمدة 8 دقائق في XG 2200 في 4 درجات مئوية.
20. Resuspend spheroplasts مكعبات الثلج في تجانس العازلة الباردة [6.5 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز].
21. نقل الخلايا إلى ما قبل المبردة على الثلج الزجاج الخالط.
22. باستخدام مدقة ضيقة ، التجانس الخلايا السكتات الدماغية عن طريق جعل 15 في مدقة.
23. إضافة 1 العازلة تجانس حجم الجليد الباردة.
24. نقل spheroplasts المتجانس إلى 50 ميلي أنابيب الطرد المركزي من البلاستيك.
25. بيليه الخلايا دون انقطاع ، نوى ، والحطام الكبيرة التي الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1500 XG في 4 درجات مئوية.
26. وطاف الطرد المركزي الناتجة عن 5 دقائق في 3000 XG في 4 درجات مئوية.
27. وطاف الطرد المركزي الناجمة عن 15 دقيقة في XG 12000 في 4 درجات مئوية.
28. صب وطاف بيليه resuspend في الجليد الباردة العازلة التجانس [6.5 مل من الخلايا (الوزن الرطب) العازلة / ز].
29. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 XG في 4 درجات مئوية.
30. وطاف الطرد المركزي الناجمة عن 15 دقيقة في XG 12000 في 4 درجات مئوية.
31. صب وطاف بيليه resuspend في 3 مل من العازلة SEM الجليد الباردة.

** على الرغم من أن هذا التعليق المخصب في الميتوكوندريا ، كما أنه يحتوي على عضيات أخرى مثل شبكية هيولي باطني (microsomes) ، غولجي ، والفجوات. للحصول على الميتوكوندريا نقية ، يمكن إخضاع هذا الكسر الخام الميتوكوندريا إلى مزيد من التجزئة ، كما هو موضح أدناه **.

تنقية الميتوكوندريا خالية من التلوث العضيات الأخرى

1. مكان 1.5 مل من 60 ٪ من الجليد الباردة (ث / ت) السكروز في EM العازلة في جهاز للطرد المركزي بيكمان أنبوب فائقة الوضوح.
2. تراكب 60 ٪ (W / V) السكروز مع 4 مل من 32 ٪ ، و 1.5 مل من 23 ٪ ، و 1.5 مل من 15 ٪ سكروز (جميع عازلة بالوزن / V في EM).
3. 3 مل من مكان الكسر في الميتوكوندريا الخام في SEM العازلة على أعلى من 15 ٪ (W / V) السكروز.
4. أجهزة الطرد المركزي في الدوار SW41 بيكمان الدلو المتأرجح تي في : 1 ح 134000 XG (33000 دورة في الدقيقة) في 4 درجات مئوية.
5. شكل فرقة موسيقية سليمة الميتوكوندريا البني في 60 ٪ / واجهة السكروز 32 ٪.
6. إزالة بعناية السكروز حتى تصل الفرقة الميتوكوندريا.
7. إزالة الفرقة الميتوكوندريا باستخدام ماصة مع طرف قطع ووضعها في أنبوب الطرد المركزي لبيكمان الدوار MLS - 5.
8. ملء الأنبوب مع العازلة SEM.
9. بيليه الميتوكوندريا النقي عن طريق الطرد المركزي في الدوار MLS - 5 لمدة 30 دقيقة في XG 10000 (31000 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
10. صب طاف بهماصة.
11. استخدام الميتوكوندريا نقية للتحليل وظائف الميتوكوندريا ، والميتوكوندريا بروتيوم lipidome ، والحمض النووي.

الكواشف

1. DTT العازلة [100 ملي Tris/H2SO4 (الرقم الهيدروجيني 9.4) ، 10 ملي dithiothreitol] (15 مل)
   • 1.5 مل من 1 العازلة Tris/H2SO4 M (الرقم الهيدروجيني 9.4)
   • 150 ميكرولتر من DTT M 1
   • إلى حجم 15 مل
2. Zymolyase العازلة [البوتاسيوم 20 ملي الفوسفات (درجة الحموضة 7.4) ، 1.2 M السوربيتول] (100 مل)
   • 2 مل من 1 M البوتاسيوم العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.4)
   • 60 مل من 2 M السوربيتول
   • لحجم 100 مل
3. العازلة التجانس [10 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة) ، و 0.6 M السوربيتول ، 1 ملم EDTA ، 0.2 ٪ (ث / ت) BSA] (250 مل]
   • 2.5 مل من تريس M 1 / العازلة حمض الهيدروكلوريك (7.4 درجة الحموضة)
   • 75 مل من 2 M السوربيتول
   • 500 ميكرولتر من EDTA 500 مم
   • 0.5 غرام من جيش صرب البوسنة
   • لحجم 250 مل
4. SEM العازلة [10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (7.2 درجة الحموضة) ، و 250 السكروز ملم ، 1 ملم EDTA] (250 مل)
   • 2.5 مل من اجتماعات الأطراف M 1 / KOH العازلة (درجة الحموضة 7.2)
   • 31.25 مل من السكروز م 2
   • 500 ميكرولتر من EDTA 500 مم
   • لحجم 250 مل
5. EM العازلة [10 ملي اجتماعات الأطراف / KOH (7.2 درجة الحموضة) ، 1 ملم EDTA] (250 مل)
   • 2.5 مل من اجتماعات الأطراف M 1 / KOH العازلة (درجة الحموضة 7.2)
   • 500 ميكرولتر من EDTA 500 مم
   • لحجم 250 مل

Discussion

هذه الطريقة تمكن من عزل عالية الغلة من الميتوكوندريا نقية من خلايا الخميرة. الميتوكوندريا يطهر هذا الأسلوب أساسا خالية من التلوث وغيرها من العضيات المحافظة على سلامتها الهيكلية والوظيفية الخاصة بهم بعد تنقيتها. عائدات الطريقة الموصوفة الميتوكوندريا التي هي مناسبة...