Очистка Митохондрии из дрожжей Клетки

Резюме

Мы описываем быстрым и эффективным методом для очистки от митохондрий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE. Этот метод позволяет высокодоходные выделения чистых митохондрий, которые в основном свободны от загрязнения другие органеллы и сохраняют свою структурную и функциональную целостность после их очистки.

Аннотация

Митохондрии являются основным местом производства АТФ во время аэробного метаболизма в эукариотических без фотосинтезирующих клеток

протокол

Материалы и методы

Штаммов дрожжей и условий роста

Штамма дикого типа BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) был выращен в богатой среде YEPD (1% дрожжевой экстракт, пептон 2%, 2% глюкозы). Клетки культивировали при 30 ° С с вращательными встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту в колбах Эрленмейера на "колбе объем / средний объем" отношением 5:1.

Изоляция сырой митохондриальной фракции

1. Расти 1 л дикого типа культуры BY4742 напряжение в течение 48 ч.
2. Налейте культуры в 500-мл пробирки Nalgene центрифуги. Баланс нагрузки и урожай клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
3. Декантировать супернатант и гранулированный ресуспендирования клеток в 250 мл dH2O. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
4. Декантировать супернатант и гранулированный ресуспендирования клеток в 250 мл dH2O. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
5. Определить живого веса осадок клеток.
6. Ресуспендируют гранулированных клеток в DTT буфера [2 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
7. Передача клеточной суспензии до 50-мл пробирки Сокол пластика.
8. Поворот трубы на 70 мин в шейкере в течение 20 мин при 30 ° С.
9. Урожай клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
10. Ресуспендируют гранулированных клеток в Zymolyase буфера без Zymolyase [7 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
11. Гранул клетки центрифугированием в течение 5 мин при 3000 мкг при комнатной температуре.
12. Ресуспендируют гранулированных клеток в Zymolyase буфера без Zymolyase [7 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
13. Передача клеточной суспензии в стеклянную колбу.
14. Добавить порошок Zymolyase-100Т [1 мг Zymolyase-100T / г (сырого веса) клетки] для клеточной суспензии.
15. Поворот колбу с клеточной суспензии при 70 мин в шейкере в течение 30 мин при 30 ° С.
16. Передача сферопластов формируется за счет переваривания клеточной стенки с Zymolyase-100T в 50-мл пластиковые трубки центрифуги.
17. Гранул сферопластов центрифугированием в течение 8 мин при 2200 мкг при 4 ° C.

** Все последующие шаги должны проводиться при температуре 4 ° С или на льду. Суспензии сферопластов следует обращаться осторожно использованием пипетки с вырезом советов, чтобы избежать нарушения органелл .**

18. Ресуспендируют гранулированный сферопластов в ледяной гомогенизации буфера [6,5 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
19. Гранул сферопластов центрифугированием в течение 8 мин при 2200 мкг при 4 ° C.
20. Ресуспендируют гранулированный сферопластов в ледяной гомогенизации буфера [6,5 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
21. Передача клетки предварительно охлажденные на льду стеклянного гомогенизатора.
22. Использование жесткой пестиком, гомогенизации клетки, делая 15 ударов пестиком.
23. Добавить 1 объем ледяной гомогенизации буфера.
24. Передача гомогенизированный сферопластов в 50-мл пластиковые трубки центрифуги.
25. Гранул непрерывно клетки, ядра, и крупные обломки центрифугированием в течение 5 мин при 1500 мкг при 4 ° C.
26. Центрифуга Полученный супернатант в течение 5 мин при 3000 мкг при 4 ° C.
27. Центрифуга Полученный супернатант в течение 15 мин при 12000 мкг при 4 ° C.
28. Декантировать супернатант и ресуспендируйте гранул в ледяной буфера гомогенизации [6,5 мл буфера / г (сырого веса) клетки].
29. Центрифуга в течение 5 мин при 3000 мкг при 4 ° C.
30. Центрифуга Полученный супернатант в течение 15 мин при 12000 мкг при 4 ° C.
31. Декантировать супернатант и ресуспендируют осадок в 3 мл ледяного буфера SEM.

** Хотя эта приостановка обогащается в митохондриях, он также содержит другие органеллы, такие как эндоплазматическая сеть (микросом), Гольджи и вакуоли. Чтобы получить чистую митохондрии, этой грубой митохондриальной фракции могут быть подвергнуты дальнейшему фракционирования, как описано ниже .**

Очистка митохондрий лишенный загрязнения другие органеллы

1. Место 1,5 мл ледяной 60% (вес / объем) сахарозы в EM буфера в Бекман Ultra-Очистить центрифуге трубки.
2. Overlay 60% (вес / объем) сахарозы с 4 мл 32%, 1,5 мл на 23%, 1,5 мл 15% сахарозы (все веса в / в в EM буфера).
3. Место 3 мл сырой митохондриальной фракции в SEM буфера на вершине 15% (вес / объем) сахарозы.
4. Центрифуга в Бекман SW41 Ti-размахивая ведром ротора течение 1 ч при 134 000 мкг (33000 оборотов в минуту) при 4 ° C.
5. Интактных митохондриях форме бурой полосой на 60% / 32% сахарозы интерфейс.
6. Осторожно снимите сахарозы до достижения митохондриальной группы.
7. Удалить митохондриальной группы с помощью пипетки с разрезом наконечник и поместить его в трубочку центрифуги Beckman для MLS-5 ротора.
8. Заполните трубку с буфером SEM.
9. Гранул чистого митохондрий с помощью центрифугирования в MLS-5 ротора в течение 30 мин при 10000 мкг (31000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при 4 ° C.
10. Декантировать супернатант использованиемпипетки.
11. Используйте чистую митохондрии для анализа митохондриальной функции, митохондриальная протеома и lipidome и митохондриальной ДНК.

Реагенты

1. DTT буфера [100 мМ Tris/H2SO4 (рН 9,4), 10 мМ дитиотреитол] (на 15 мл)
   • 1,5 мл 1 М Tris/H2SO4 буфера (рН 9,4)
   • 150 мкл 1 М ДТТ
   • Тома до 15 мл
2. Zymolyase буфере [20 мМ фосфата калия (рН 7,4), 1,2 М сорбит] (на 100 мл)
   • 2 мл 1 М фосфатного буфера калия (рН 7,4)
   • 60 мл 2 М сорбит
   • Тома до 100 мл
3. Гомогенизация буфере [10 мМ Tris / HCl (рН 7,4), 0,6 М сорбит, 1 мМ ЭДТА, 0,2% (м / о) BSA] (на 250 мл]
   • 2,5 мл 1 М Трис / HCl буфером (рН 7,4)
   • 75 мл 2 М сорбит
   • 500 мкл 500 мМ ЭДТА
   • 0,5 г BSA
   • Тома до 250 мл
4. SEM буфере [10 мМ MOPS / КОН (рН 7,2), 250 мМ сахарозы, 1 мМ ЭДТА] (на 250 мл)
   • 2,5 мл 1 MOPS М / КОН буфером (рН 7,2)
   • 31,25 мл 2 М сахарозы
   • 500 мкл 500 мМ ЭДТА
   • Тома до 250 мл
5. Е. М. буфере [10 мМ MOPS / КОН (рН 7,2), 1 мМ ЭДТА] (на 250 мл)
   • 2,5 мл 1 MOPS М / КОН буфером (рН 7,2)
   • 500 мкл 500 мМ ЭДТА
   • Тома до 250 мл

Обсуждение

Этот метод позволяет высокодоходные выделения чистых митохондрий из клеток дрожжей. Митохондрии очищают этот метод в основном свободны от загрязнения другие органеллы и сохраняют свою структурную и функциональную целостность после их очистки. Описанный метод дает митохондрий, кото?...