Purificazione dei mitocondri da cellule di lievito

Riepilogo

Descriviamo un metodo rapido ed efficace per la purificazione dei mitocondri dal lievito Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente ad alto rendimento puro isolamento di mitocondri che sono essenzialmente privo di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione.

Abstract

I mitocondri sono la sede principale della produzione di ATP durante il metabolismo aerobico in eucarioti fotosintetici non-cellule

Protocollo

Materiali e metodi

Ceppi di lievito e le condizioni di crescita

Il ceppo selvatico BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) era cresciuto in media ricca YEPD (1 estratto di lievito%, 2% peptone, 2% di glucosio). Le cellule sono state coltivate a 30 ° C con agitazione di rotazione a 200 rpm in beute con un rapporto "fiasco volume / medio volume" di 5:1.

Isolamento del greggio frazione mitocondriale

1. Crescere 1 L di wild-type cultura ceppo BY4742 per 48 h.
2. Versare la cultura in 500 ml provette Nalgene. Bilanciare il carico e le cellule raccolto per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
3. Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
4. Decantare le cellule surnatante e risospendere pellet in 250 ml di dH2O. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
5. Determinare peso fresco di pellet.
6. Risospendere le cellule in un tampone di pellet DTT [2 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
7. Trasferire la sospensione cellulare a 50 ml, tubi di plastica Falcon.
8. Ruotare le provette a 70 rpm in uno shaker per 20 minuti a 30 ° C.
9. Celle di raccolta per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
10. Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
11. Celle a pellet per centrifugazione per 5 min a 3000 xg a temperatura ambiente.
12. Risospendere le cellule in un tampone di pellet Zymolyase senza Zymolyase [7 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
13. Trasferimento sospensione cellulare in un pallone di vetro.
14. Aggiungere la polvere di Zymolyase-100T [1 mg di Zymolyase-100T / g (peso fresco), le cellule] alla sospensione cellulare.
15. Ruotare il pallone con sospensione cellulare a 70 giri in uno shaker per 30 minuti a 30 ° C.
16. Sferoplasti trasferimento formata a causa della digestione della parete cellulare con Zymolyase-100T in provette di plastica da 50 ml centrifuga.
17. Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C.

** Tutti i passi successivi devono essere effettuate a 4 ° C o in ghiaccio. Sospensioni di sferoplasti devono essere trattati con delicatezza usando pipette con punte tagliate per evitare di rompere organelli .**

18. Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
19. Pellet sferoplasti per centrifugazione per 8 minuti a 2200 xga 4 ° C.
20. Risospendere sferoplasti pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
21. Trasferimento alle cellule di un pre-raffreddata in ghiaccio vetro omogeneizzatore.
22. Utilizzando un pestello stretto, omogeneizzare le cellule facendo 15 colpi di pestello.
23. Aggiungere 1 volume di ghiaccio, freddo buffer di omogeneizzazione.
24. Trasferimento sferoplasti omogeneizzato in provette di plastica da 50 ml centrifuga.
25. Pellet di cellule ininterrotta, nuclei e detriti di grandi dimensioni per centrifugazione per 5 min a 1500 xga 4 ° C.
26. Centrifugare il surnatante risultante per 5 min a 3000 xga 4 ° C.
27. Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C.
28. Decantare il surnatante e risospendere pellet in ghiacciato buffer di omogeneizzazione [6,5 ml di tampone / g (peso fresco) cellule].
29. Centrifugare per 5 min a 3000 xga 4 ° C.
30. Centrifugare il surnatante risultante per 15 min a 12000 xga 4 ° C.
31. Decantare il surnatante e risospendere pellet in 3 ml di ghiacciata tampone SEM.

** Anche se questa sospensione è arricchita nei mitocondri, organelli contiene anche altri come il reticolo endoplasmatico (microsomi), Golgi, e vacuoli. Per ottenere i mitocondri pura, questa frazione greggio mitocondriale può essere sottoposto a ulteriore frazionamento, come descritto di seguito .**

Purificazione di mitocondri privi di contaminazione da parte di altri organuli

1. Mettere 1,5 ml di ghiacciata 60% (w / v) di saccarosio nel tampone EM in un Ultra-Clear provetta da centrifuga Beckman.
2. Sovrapposizione del 60% (w / v) con 4 ml di saccarosio del 32%, 1,5 ml del 23%, 1,5 ml di 15% di saccarosio (tutti p / v in tampone EM).
3. Mettere 3 ml della frazione mitocondriale greggio in SEM tampone sulla parte superiore del 15% (w / v) di saccarosio.
4. Centrifuga in un SW41 Beckman Ti oscillante-rotore per 1 ora a 134000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C.
5. La forma mitocondri intatti una fascia marrone al 60% / interfaccia di saccarosio 32%.
6. Rimuovere con attenzione saccarosio fino a raggiungere la band mitocondriale.
7. Rimuovere la banda mitocondriale usando una pipetta con la punta tagliata e metterla in una provetta da centrifuga di un rotore Beckman-5 MLS.
8. Riempire il tubo con tampone SEM.
9. Pellet i mitocondri puro per centrifugazione in un MLS-5 rotore per 30 minuti a 10000 xg (31000 rpm) per 30 minuti a 4 ° C.
10. Decantare il surnatante utilizzandouna pipetta.
11. Utilizzare i mitocondri pura per l'analisi delle funzioni mitocondriali, proteoma mitocondriale e lipidome, e del DNA mitocondriale.

Reagenti

1. DTT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitolo] (per 15 ml)
   • 1,5 ml di buffer di 1 M Tris/H2SO4 (pH 9,4)
   • 150 ml di 1 M DTT
   • Il volume a 15 ml
2. Zymolyase tampone [20 mM di potassio fosfato (pH 7,4), sorbitolo 1,2 M] (per 100 ml)
   • 2 ml di 1 M tampone fosfato di potassio (pH 7,4)
   • 60 ml di 2 M sorbitolo
   • Il volume a 100 ml
3. Buffer di omogeneizzazione [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitolo, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v) di BSA] (per 250 ml]
   • 2,5 ml di 1 M Tris / HCl (pH 7,4)
   • 75 ml di 2 M sorbitolo
   • 500 microlitri di 500 mM EDTA
   • 0,5 g di BSA
   • Il volume a 250 ml
4. SEM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM saccarosio, 1 mM EDTA] (per 250 ml)
   • 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2)
   • 31,25 ml di 2 M saccarosio
   • 500 microlitri di 500 mM EDTA
   • Il volume a 250 ml
5. EM tampone [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (per 250 ml)
   • 2,5 ml di 1 M MOPS / KOH tampone (pH 7,2)
   • 500 microlitri di 500 mM EDTA
   • Il volume a 250 ml

Discussione

Questo metodo consente ad alto rendimento puro isolamento dei mitocondri da cellule di lievito. I mitocondri purificati con questo metodo sono essenzialmente priva di contaminazione da parte di altri organuli e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale dopo la loro purificazione. I rendimenti metodo descritto mitocondri che sono adatti per cell-free ricostituzione di processi essenziali mitocondriale. Questi mitocondri elevata purezza può essere utilizzato anche per l'analisi della struttura e delle fu...