材料和方法
酵母菌株和生长条件。
丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0)(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖) 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。
原油线粒体分数隔离
- 长为48小时1升的野生型菌株BY4742文化
- 倒入500毫升NALGENE离心管文化。平衡离心负载和收获细胞在室温下在3000 XG 5分钟。
- 倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟,离心沉淀细胞。
- 倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟,离心沉淀细胞。
- 确定细胞沉淀湿重。
- 重悬浮颗粒细胞,在数码地面电视的缓冲缓冲/克(湿重)细胞[2毫升]。
- 将细胞悬液50毫升猎鹰塑料管。
- 70在摇床转速在30 ° C 20分钟的旋转管
- 在3000 XG在室温下5分钟,离心收集细胞。
- Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞重悬于无Zymolyase毫升缓冲/克(湿重)细胞[7 ]。
- 在3000 XG在室温下5分钟,离心沉淀细胞。
- Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞重悬于无Zymolyase毫升缓冲/克(湿重)细胞[7 ]。
- 细胞悬液转移到一个玻璃瓶中。
- 添加粉末Zymolyase - 100T [1毫克Zymolyase - 100T /克(湿重)的细胞,细胞悬液。
- 70在摇床转速旋转烧瓶与细胞悬液,在30 ° C 30分钟
- 传输原生质球形成由于Zymolyase - 100T至50毫升塑料离心管细胞壁的消化。
- 佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C
**所有后续步骤,应在4℃或冰面上进行。原生质球悬浮应轻轻削减提示使用移液器,以避免破坏细胞器处理**
- 在同质化冰冷的缓冲缓冲/克(湿重)细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。
- 佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C
- 在同质化冰冷的缓冲缓冲/克(湿重)细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。
- 转移到玻璃匀浆冰预冷的细胞。
- 使用一紧杵,均质15招杵细胞。
- 加入1体积冰冷的同质化缓冲区。
- 同质化原生质球转移至50毫升塑料离心管。
- 颗粒完整细胞,细胞核,并在1500 XG 5分钟离心4大碎片° C。
- 离心机3000 XG 5分钟产生的上清液在4 ° C。
- 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。
- 倒出上清液,沉淀重悬在冰冷的同质化缓冲区[6.5毫升缓冲/克(湿重)细胞]。
- 3000 XG 5分钟离心4 ° C。
- 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。
- 倒出上清液,重悬沉淀在冰冷的扫描电镜缓冲区3毫升。
**虽然这种悬挂在线粒体丰富,还含有其它细胞器,如内质网(微粒),高尔基体和空泡。为了得到纯净的线粒体,这种原油的线粒体分数可以受到进一步的分馏,如下所述**
线粒体的没有污染的其他细胞器的分离纯化
- 广场1.5毫升冰冷的60%(W / V)蔗糖的EM缓冲区成贝克曼超清晰的离心管。
- 覆盖60%(W / V)4毫升32%的蔗糖,1.5毫升23%,1.5毫升15%的蔗糖(所有WT / V在EM缓冲区)。
- 将3毫升15%(W / V)蔗糖顶部原油在SEM中的缓冲区的线粒体的一小部分。
- 在一个贝克曼SW41钛摆动斗1小时134000 XG(33000 RPM)在4 ° C转子离心机
- 完整的线粒体形式在60%/ 32%的蔗糖界面的棕色带。
- 小心取出,直到达到线粒体乐队的蔗糖。
- 删除一个切尖线粒体的乐队,用吸管和一个MLS - 5转子放入一个贝克曼离心管。
- 用SEM缓冲区的填充管。
- MLS - 5 10000 XG(31000 RPM)为30分钟30分钟的转子离心沉淀的纯线粒体在4 ° C。
- 倒出上清液采用吸管。
- 使用纯线粒体线粒体功能,线粒体蛋白质组和lipidome和线粒体DNA的分析。
试剂
- 数码地面电视的缓冲区[Tris/H2SO4(pH 9.4)的100毫米,10毫米二硫苏糖醇(15毫升)
- 1.5毫升1个M Tris/H2SO4缓冲液(pH值9.4)
- 150μL的1 M数码地面电视
- 卷15毫升
- Zymolyase缓冲液[20毫米磷酸钾(pH值7.4),1.2米山梨醇](100毫升)
- 2毫升1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)
- 60毫升的2米山梨醇
- 容至100 ml
- 同质化缓冲液[10毫米的Tris /盐酸(pH值7.4),0.6米山梨糖醇,1 mM的EDTA,0.2%(W / V)牛血清白蛋白(250毫升]
- 2.5毫升的1 M Tris / HCl缓冲液(pH值7.4)
- 75毫升的2米山梨醇
- 500μL500 mM的EDTA
- 0.5克的BSA
- 容积250毫升
- 扫描电镜缓冲区[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾(pH值7.2),蔗糖250毫米,1毫米EDTA](250毫升)
- 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液(pH值7.2)
- 31.25毫升2米蔗糖
- 500μL500 mM的EDTA
- 容积250毫升
- 电磁缓冲液[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾(pH值7.2),1 mM的EDTA](250毫升)
- 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液(pH值7.2)
- 500μL500 mM的EDTA
- 容积250毫升