从酵母细胞线粒体的纯化

摘要

我们描述了一个快速和有效的方法纯化的酵母线粒体酿酒酵母。这种方法使高产纯线粒体隔离，其他细胞器的污染基本上是免费的，并保留其净化后的结构和功能完整性。

摘要

线粒体是ATP生产的主要场所，在真核细胞非光合细胞的有氧代谢

研究方案

材料和方法

酵母菌株和生长条件。

丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0）（1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖） 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。

原油线粒体分数隔离

1. 长为48小时1升的野生型菌株BY4742文化
2. 倒入500毫升NALGENE离心管文化。平衡离心负载和收获细胞在室温下在3000 XG 5分钟。
3. 倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟，离心沉淀细胞。
4. 倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟，离心沉淀细胞。
5. 确定细胞沉淀湿重。
6. 重悬浮颗粒细胞，在数码地面电视的缓冲缓冲/克（湿重）细胞[2毫升]。
7. 将细胞悬液50毫升猎鹰塑料管。
8. 70在摇床转速在30 ° C 20分钟的旋转管
9. 在3000 XG在室温下5分钟，离心收集细胞。
10. Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞重悬于无Zymolyase毫升缓冲/克（湿重）细胞[7 ]。
11. 在3000 XG在室温下5分钟，离心沉淀细胞。
12. Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞重悬于无Zymolyase毫升缓冲/克（湿重）细胞[7 ]。
13. 细胞悬液转移到一个玻璃瓶中。
14. 添加粉末Zymolyase - 100T [1毫克Zymolyase - 100T /克（湿重）的细胞，细胞悬液。
15. 70在摇床转速旋转烧瓶与细胞悬液，在30 ° C 30分钟
16. 传输原生质球形成由于Zymolyase - 100T至50毫升塑料离心管细胞壁的消化。
17. 佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C

**所有后续步骤，应在4℃或冰面上进行。原生质球悬浮应轻轻削减提示使用移液器，以避免破坏细胞器处理**

18. 在同质化冰冷的缓冲缓冲/克（湿重）细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。
19. 佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C
20. 在同质化冰冷的缓冲缓冲/克（湿重）细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。
21. 转移到玻璃匀浆冰预冷的细胞。
22. 使用一紧杵，均质15招杵细胞。
23. 加入1体积冰冷的同质化缓冲区。
24. 同质化原生质球转移至50毫升塑料离心管。
25. 颗粒完整细胞，细胞核，并在1500 XG 5分钟离心4大碎片° C。
26. 离心机3000 XG 5分钟产生的上清液在4 ° C。
27. 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。
28. 倒出上清液，沉淀重悬在冰冷的同质化缓冲区[6.5毫升缓冲/克（湿重）细胞]。
29. 3000 XG 5分钟离心4 ° C。
30. 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。
31. 倒出上清液，重悬沉淀在冰冷的扫描电镜缓冲区3毫升。

**虽然这种悬挂在线粒体丰富，还含有其它细胞器，如内质网（微粒），高尔基体和空泡。为了得到纯净的线粒体，这种原油的线粒体分数可以受到进一步的分馏，如下所述**

线粒体的没有污染的其他细胞器的分离纯化

1. 广场1.5毫升冰冷的60％（W / V）蔗糖的EM缓冲区成贝克曼超清晰的离心管。
2. 覆盖60％（W / V）4毫升32％的蔗糖，1.5毫升23％，1.5毫升15％的蔗糖（所有WT / V在EM缓冲区）。
3. 将3毫升15％（W / V）蔗糖顶部原油在SEM中的缓冲区的线粒体的一小部分。
4. 在一个贝克曼SW41钛摆动斗1小时134000 XG（33000 RPM）在4 ° C转子离心机
5. 完整的线粒体形式在60％/ 32％的蔗糖界面的棕色带。
6. 小心取出，直到达到线粒体乐队的蔗糖。
7. 删除一个切尖线粒体的乐队，用吸管和一个MLS - 5转子放入一个贝克曼离心管。
8. 用SEM缓冲区的填充管。
9. MLS - 5 10000 XG（31000 RPM）为30分钟30分钟的转子离心沉淀的纯线粒体在4 ° C。
10. 倒出上清液采用吸管。
11. 使用纯线粒体线粒体功能，线粒体蛋白质组和lipidome和线粒体DNA的分析。

试剂

1. 数码地面电视的缓冲区[Tris/H2SO4（pH 9.4）的100毫米，10毫米二硫苏糖醇（15毫升）
   • 1.5毫升1个M Tris/H2SO4缓冲液（pH值9.4）
   • 150μL的1 M数码地面电视
   • 卷15毫升
2. Zymolyase缓冲液[20毫米磷酸钾（pH值7.4），1.2米山梨醇]（100毫升）
   • 2毫升1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）
   • 60毫升的2米山梨醇
   • 容至100 ml
3. 同质化缓冲液[10毫米的Tris /盐酸（pH值7.4），0.6米山梨糖醇，1 mM的EDTA，0.2％（W ​​/ V）牛血清白蛋白（250毫升]
   • 2.5毫升的1 M Tris / HCl缓冲液（pH值7.4）
   • 75毫升的2米山梨醇
   • 500μL500 mM的EDTA
   • 0.5克的BSA
   • 容积250毫升
4. 扫描电镜缓冲区[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾（pH值7.2），蔗糖250毫米，1毫米EDTA]（250毫升）
   • 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液（pH值7.2）
   • 31.25毫升2米蔗糖
   • 500μL500 mM的EDTA
   • 容积250毫升
5. 电磁缓冲液[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾（pH值7.2），1 mM的EDTA]（250毫升）
   • 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液（pH值7.2）
   • 500μL500 mM的EDTA
   • 容积250毫升

讨论

这种方法使高产的隔离从酵母细胞中的纯线粒体。通过这种方法纯化的线粒体其他细胞器的污染基本上是免费的，其净化后保留其结构和功能的完整性。所述的方法产生的线粒体适用于无细胞重组基本线粒体过程。这些高度纯净的线粒体也可以用于线粒体结构和功能，线粒体蛋白质组和lipidome，和线粒体DNA的分析。