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摘要

我们描述了一个快速和有效的方法纯化的酵母线粒体酿酒酵母。这种方法使高产纯线粒体隔离,其他细胞器的污染基本上是免费的,并保留其净化后的结构和功能完整性。

摘要

线粒体是ATP生产的主要场所,在真核细胞非光合细胞的有氧代谢

研究方案

材料和方法

酵母菌株和生长条件。

丰富YEPD培养基中生长的野生型菌株BY4742(MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0)(1%酵母提取物,2%蛋白胨,2%葡萄糖) 。细胞培养在30 ° C旋转摇晃锥形瓶在200 RPM“瓶体积/中等音量”5:1的比例。

原油线粒体分数隔离

  1. 长为48小时1升的野生型菌株BY4742文化
  2. 倒入500毫升NALGENE离心管文化。平衡离心负载和收获细胞在室温下在3000 XG 5分钟。
  3. 倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟,离心沉淀细胞。
  4. 倒出上清液在250毫升的dH2O颗粒和悬浮细胞。在3000 XG在室温下5分钟,离心沉淀细胞。
  5. 确定细胞沉淀湿重。
  6. 重悬浮颗粒细胞,在数码地面电视的缓冲缓冲/克(湿重)细胞[2毫升]。
  7. 将细胞悬液50毫升猎鹰塑料管。
  8. 70在摇床转速在30 ° C 20分钟的旋转管
  9. 在3000 XG在室温下5分钟,离心收集细胞。
  10. Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞悬于无Zymolyase毫升缓冲/克(湿重)细胞[7 ]。
  11. 在3000 XG在室温下5分钟,离心沉淀细胞。
  12. Zymolyase缓冲区中的颗粒细胞悬于无Zymolyase毫升缓冲/克(湿重)细胞[7 ]。
  13. 细胞悬液转移到一个玻璃瓶中。
  14. 添加粉末Zymolyase - 100T [1毫克Zymolyase - 100T /克(湿重)的细胞,细胞悬液。
  15. 70在摇床转速旋转烧瓶与细胞悬液,在30 ° C 30分钟
  16. 传输原生质球形成由于Zymolyase - 100T至50毫升塑料离心管细胞壁的消化。
  17. 佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C

**所有后续步骤,应在4℃或冰面上进行。原生质球悬浮应轻轻削减提示使用移液器,以避免破坏细胞器处理**

  1. 在同质化冰冷的缓冲缓冲/克(湿重)细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。
  2. 佩莱原生质球离心8分钟在2200 XG在4 ° C
  3. 在同质化冰冷的缓冲缓冲/克(湿重)细胞[6.5毫升]重悬沉淀的原生质球。
  4. 转移到玻璃匀浆冰预冷的细胞。
  5. 使用一紧杵,均质15招杵细胞。
  6. 加入1体积冰冷的同质化缓冲区。
  7. 同质化原生质球转移至50毫升塑料离心管。
  8. 颗粒完整细胞,细胞核,并在1500 XG 5分钟离心4大碎片° C。
  9. 离心机3000 XG 5分钟产生的上清液在4 ° C。
  10. 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。
  11. 倒出上清液,沉淀重悬在冰冷的同质化缓冲区[6.5毫升缓冲/克(湿重)细胞]。
  12. 3000 XG 5分钟离心4 ° C。
  13. 15分钟产生的上清液离心12000 XG在4 ° C。
  14. 倒出上清液,重悬沉淀在冰冷的扫描电镜缓冲区3毫升。

**虽然这种悬挂在线粒体丰富,还含有其它细胞器,如内质网(微粒),高尔基体和空泡。为了得到纯净的线粒体,这种原油的线粒体分数可以受到进一步的分馏,如下所述**

线粒体的没有污染的其他细胞器的分离纯化

  1. 广场1.5毫升冰冷的60%(W / V)蔗糖的EM缓冲区成贝克曼超清晰的离心管。
  2. 覆盖60%(W / V)4毫升32%的蔗糖,1.5毫升23%,1.5毫升15%的蔗糖(所有WT / V在EM缓冲区)。
  3. 将3毫升15%(W / V)蔗糖顶部原油在SEM中的缓冲区的线粒体的一小部分。
  4. 在一个贝克曼SW41钛摆动斗1小时134000 XG(33000 RPM)在4 ° C转子离心机
  5. 完整的线粒体形式在60%/ 32%的蔗糖界面的棕色带。
  6. 小心取出,直到达到线粒体乐队的蔗糖。
  7. 删除一个切尖线粒体的乐队,用吸管和一个MLS - 5转子放入一个贝克曼离心管。
  8. 用SEM缓冲区的填充管。
  9. MLS - 5 10000 XG(31000 RPM)为30分钟30分钟的转子离心沉淀的纯线粒体在4 ° C。
  10. 倒出上清液采用吸管。
  11. 使用纯线粒体线粒体功能,线粒体蛋白质组和lipidome和线粒体DNA的分析。

试剂

  1. 数码地面电视的缓冲区[Tris/H2SO4(pH 9.4)的100毫米,10毫米二硫苏糖醇(15毫升)
    • 1.5毫升1个M Tris/H2SO4缓冲液(pH值9.4)
    • 150μL的1 M数码地面电视
    • 卷15毫升
  2. Zymolyase缓冲液[20毫米磷酸钾(pH值7.4),1.2米山梨醇](100毫升)
    • 2毫升1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)
    • 60毫升的2米山梨醇
    • 容至100 ml
  3. 同质化缓冲液[10毫米的Tris /盐酸(pH值7.4),0.6米山梨糖醇,1 mM的EDTA,0.2%(W ​​/ V)牛血清白蛋白(250毫升]
    • 2.5毫升的1 M Tris / HCl缓冲液(pH值7.4)
    • 75毫升的2米山梨醇
    • 500μL500 mM的EDTA
    • 0.5克的BSA
    • 容积250毫升
  4. 扫描电镜缓冲区[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾(pH值7.2),蔗糖250毫米,1毫米EDTA](250毫升)
    • 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液(pH值7.2)
    • 31.25毫升2米蔗糖
    • 500μL500 mM的EDTA
    • 容积250毫升
  5. 电磁缓冲液[10毫米公开资讯观测站/氢氧化钾(pH值7.2),1 mM的EDTA](250毫升)
    • 2.5毫升1个M MOPS /氢氧化钾缓冲液(pH值7.2)
    • 500μL500 mM的EDTA
    • 容积250毫升

讨论

这种方法使高产的隔离从酵母细胞中的纯线粒体。通过这种方法纯化的线粒体其他细胞器的污染基本上是免费的,其净化后保留其结构和功能的完整性。所述的方法产生的线粒体适用于无细胞重组基本线粒体过程。这些高度纯净的线粒体也可以用于线粒体结构和功能,线粒体蛋白质组和lipidome,和线粒体DNA的分析。

披露声明

The authors have nothing to disclose.

致谢

这项工作得到了CIHR和加拿大NSERC资助。 VIT是一个新的CIHR调查和Concordia大学基因组学研究主席,细胞生物学和老化。

参考文献

  1. Voet, D., Voet, J. G. Biochemistry. , (2004).
  2. Suen, D. -. F., Norris, K. L., Youle, R. J. Mitochondrial dynamics and apoptosis. Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).
  3. Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
  4. Detmer, S. A., Chan, D. C. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).
  5. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).
  6. Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. Mitochondria, oxidants, and aging. Cell. 120, 483-495 (2005).

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