酵母細胞からミトコンドリアの精製

要約

我々は、酵母からのミトコンドリアの精製のための迅速かつ効果的な方法を説明しますサッカロマイセスセレビシエ。このメソッドは、他の細胞小器官による汚染の本質的に自由であり、それらの精製後、構造と機能の整合性を維持する純粋なミトコンドリアの高収量を可能にします。

要約

ミトコンドリアは、真核生物、非光合成細胞における好気的代謝の間にATPの生産の主なサイトです。

プロトコル

材料および方法

酵母菌株及び成長条件

野生型株BY4742（MATαhis3Δ1leu2Δ0lys2Δ0ura3Δ0が ）豊富なYEPD培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース）で増殖させた。細胞を30℃で回転が5:1の"フラスコの体積/培地体積"比での三角フラスコで200 rpmで振盪しながら培養した。

原油ミトコンドリア分画の単離

1. 48時間野生型株BY4742培養液1 Lに成長する
2. 500mlのNalgeneの遠心管に文化を注ぐ。室温で3000 × gで5分間の遠心分離により、負荷や収穫の細胞のバランスをとる。
3. dH2Oの250mlの上清をデカントし、ペレット化した細胞懸濁する。室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞をペレット化する。
4. dH2Oの250mlの上清をデカントし、ペレット化した細胞懸濁する。室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞をペレット化する。
5. 細胞ペレットの湿重量を決定します。
6. DTTバッファーでペレット化した細胞を再懸[バッファー/ g（湿重量）の細胞を2ml]。
7. 50 mlのファルコンのプラスチックチューブに細胞懸濁液を移す。
8. 30℃で20分間シェーカーで70 rpmでチューブを回転させる
9. 室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞を回収。
10. ザイモリアーゼ[バッファ/ g（湿重量）の細胞7mlの] なしザイモリアーゼバッファーでペレット化した細胞を再懸濁します。
11. 室温で3000 × gで5分間の遠心分離により細胞をペレット化する。
12. ザイモリアーゼ[バッファ/ g（湿重量）の細胞7mlの] なしザイモリアーゼバッファーでペレット化した細胞を再懸濁します。
13. ガラス製フラスコに細胞懸濁液を移す。
14. ザイモリアーゼ- 100T [ザイモリアーゼ- 100T / g（湿重量）の細胞を1mg]細胞懸濁液への粉体を​​追加。
15. 30℃で30分間シェーカーで70 rpmで細胞懸濁液でフラスコを回転させる
16. 転送フェロプラストは、ザイモリアーゼ- 100T〜50 mlのプラスチック遠心管で細胞壁の消化のために結成。
17. 4℃で2200 × gで8分間℃での遠心分離によりペレットのスフェロプラスト

**すべての後続のステップは4℃または氷上で行ってください。スフェロプラストの懸濁液を穏やかに細胞小器官を破ることを避けるため、カットのヒントをピペットを用いて処理する必要があります**

18. 氷冷均質化緩衝液[バッファ/ g（湿重量）の細胞の6.5 ML]でペレットスフェロプラストを再懸濁します。
19. 4℃で2200 × gで8分間℃での遠心分離によりペレットのスフェロプラスト
20. 氷冷均質化緩衝液[バッファ/ g（湿重量）の細胞の6.5 ML]でペレットスフェロプラストを再懸濁します。
21. 氷ガラスホモジナイザーで予備冷却するセルを転送する。
22. タイトな乳棒を用いて、乳棒の15ストロークをすることで細胞をホモジナイズする。
23. 氷冷均質化緩衝液の1ボリュームを追加します。
24. 50 mlのプラスチック遠心管に均質化スフェロプラストを転送する。
25. 4℃で1500 × gで5分間遠心してペレット切れ目のない細胞、核、および大規模な破片℃の
26. 4℃で3000 × gで5分間得られた上清を遠心℃に
27. 4℃をXGの12000で15分間、得られた上清を遠心
28. 氷冷均質化緩衝液の上清をデカントし、ペレットを再懸濁します[バッファ/ g（湿重量）の細胞の6.5ミリリットル]。
29. 4℃で3000 × gで5分間遠心する℃、
30. 4℃をXGの12000で15分間、得られた上清を遠心
31. 氷冷SEMの緩衝液3mlで上清をデカントし、ペレットを再懸濁します。

**この懸濁液をミトコンドリアに富んでいるものの、それはまた、小胞体（ミクロソーム）、ゴルジ体、および液胞などの他の小器官が含まれています。純粋なミトコンドリアを取得するには、この粗ミトコンドリア分画は、後述のように、さらに分別にかけることができます**

他の小器官による汚染のミトコンドリアを欠いての精製

1. EMの氷冷60％（w / v）ショ糖の代わりに1.5ミリリットルのベックマンウルトラクリア遠心管にバッファリング。
2. オーバーレイ60％（W / V）32％、23％液1.5 ml、15％スクロース（EMバッファ内のすべての重量/ v）を1.5 mlの4 mlのショ糖。
3. 15％（w / v）スクロースの上にSEMバッファの粗ミトコンドリア分画の3mlを置きます。
4. 4で134000 XG（33000回転）℃で1時間のためのベックマンSW41のTiスイングローターで遠心
5. 60％/ 32％スクロース界面で無傷のミトコンドリア形態は茶色のバンド。
6. 慎重にミトコンドリアのバンドに到達するまで、ショ糖を削除します。
7. カットの先端にピペットを用いてミトコンドリアのバンドを外して、MLS - 5ローターのためベックマン遠心管に入れてください。
8. SEM用緩衝液でチューブを埋める。
9. ペレット4℃で30分10000 × gで（31000 rpm）で30分間MLS - 5ローターの遠心分離によって純粋なミトコンドリア℃の
10. 使用して上清をデカントピペット。
11. ミトコンドリア機能、ミトコンドリアプロテオームとlipidome、およびミトコンドリアDNAの分析のための純粋なミトコンドリアを使用してください。

試薬

1. DTTバッファー[100 mMのTris/H2SO4液（pH 9.4）、10mMのジチオスレイトール]（15ミリリットル用）
   • 1 M Tris/H2SO4緩衝液（pH 9.4）1.5 mlの
   • 1 M DTTを150μl
   • 15mlに容積
2. ザイモリアーゼバッファー[20 mMリン酸カリウム（pH7.4）に、1.2 Mソルビトール]（100ミリリットル用）
   • 1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）を2ml
   • ソルビトール2 M 60 mlの
   • 100mlにボリューム
3. 均質化緩衝液[10mMトリス/ HCl（pH7.4）中、ソルビトール0.6 M、1mMのEDTA、0.2％（w / v）のBSA]（250ミリリットル用]
   • 1 Mトリス/ HCl緩衝液（pH7.4）2.5 mlの
   • ソルビトール2 M 75mlの
   • 500mMのEDTAを500μl
   • BSA、0.5gの
   • 250mlにボリューム
4. SEMバッファー[10 mMのMOPS / KOH（pH7.2）に、250mMスクロース、1mMのEDTA]（250ミリリットル用）
   • 1 MのMOPS / KOH緩衝液（pH7.2）2.5 mlの
   • 2 Mのショ糖の31.25ミリリットル
   • 500mMのEDTAを500μl
   • 250mlにボリューム
5. EMバッファー[10mMのMOPS / KOH（pH7.2）中、1mMのEDTA]（250ミリリットル用）
   • 1 MのMOPS / KOH緩衝液（pH7.2）2.5 mlの
   • 500mMのEDTAを500μl
   • 250mlにボリューム

ディスカッション

このメソッドは、酵母細胞から純粋なミトコンドリアの高収量を可能にします。この方法で精製したミトコンドリアは、他の小器官で、本質的に汚染の自由であり、その精製後、構造と機能の整合性を保持。本質的なミトコンドリアのプロセスの無細胞再構成に適しているミトコンドリアに記載の方法利回り。これらの高純度のミトコンドリアは、ミトコンドリアの構造と機能、ミトコンド?...