טיהור של המיטוכונדריה מתאי שמרים

Summary

אנו מתארים שיטה מהירה ויעילה לטיהור של המיטוכונדריה של השמרים Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת את הבידוד גבוהה תשואה של המיטוכונדריה טהור חופשיים בעיקרו של זיהום על ידי אברונים אחרים ולשמור על השלמות המבנית תפקודית לאחר הטיהור שלהם.

Abstract

המיטוכונדריה הם האתר העיקרי של ייצור ה-ATP במהלך המטבוליזם האירובי שאינם פוטוסינתטיים התאים האיקריוטים

Protocol

חומרים ושיטות

שמרים זנים ותנאי גידול

זן wild-type BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) היה גדל בינוני YEPD עשיר (1% תמצית שמרים, peptone 2%, גלוקוז 2%). היו תאים בתרבית בשעה 30 ° C עם הסיבוב רועד בסל"ד 200 ב צלוחיות Erlenmeyer על יחס "נפח / בינוני נפח בקבוק" של 05:01.

בידוד של חלק המיטוכונדריה גולמי

1. לגדול 1 ליטר של תרבות wild-type BY4742 זן עבור 48 ח
2. יוצקים התרבות של 500 מ"ל צינורות Nalgene צנטריפוגות. מאזן את העומס ותאי הקציר ידי צנטריפוגה 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
3. למזוג תאים pelleted supernatant ו resuspend ב 250 מ"ל של dH2O. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
4. למזוג תאים pelleted supernatant ו resuspend ב 250 מ"ל של dH2O. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
5. קביעת משקל רטוב של התא גלולה.
6. Resuspend תאים pelleted במאגר DTT [2 מ"ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים].
7. מעבירים את ההשעיה תא 50 מ"ל פלקון צינורות פלסטיק.
8. סובב את צינורות ב 70 סל"ד ב שייקר במשך 20 דקות בקצב של 30 ° C.
9. קציר תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
10. Resuspend תאים pelleted במאגר Zymolyase ללא [7 מ"ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים] Zymolyase.
11. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 3000 XG בטמפרטורת החדר.
12. Resuspend תאים pelleted במאגר Zymolyase ללא [7 מ"ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים] Zymolyase.
13. העברת ההשעיה התא בקבוק זכוכית.
14. מוסיפים את אבקת Zymolyase-100T [1 מ"ג של Zymolyase-100T / g (משקל רטוב) תאים] כדי השעיית התא.
15. סובב את הבקבוק עם ההשעיה התא ב 70 סל"ד ב שייקר למשך 30 דקות בקצב של 30 ° C.
16. Spheroplasts העברת שנוצר עקב עיכול של התא הקיר עם Zymolyase-100T ל -50 מ"ל צנטריפוגות צינורות פלסטיק.
17. גלולה spheroplasts ידי צנטריפוגה 8 דקות ב 2200 XG ב 4 ° C.

** כל הצעדים הבאים צריכים להתבצע על 4 מעלות צלזיוס או על קרח. המתלים של spheroplasts יש לטפל בעדינות באמצעות טפטפות עם טיפים לחתוך כדי למנוע שבירת האברונים .**

18. Resuspend spheroplasts pelleted במאגר קר כקרח homogenization [6.5 מ"ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים].
19. גלולה spheroplasts ידי צנטריפוגה 8 דקות ב 2200 XG ב 4 ° C.
20. Resuspend spheroplasts pelleted במאגר קר כקרח homogenization [6.5 מ"ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים].
21. העברת תאים טרום מצוננים על קרח בכוס homogenizer.
22. באמצעות העלי הדוק, homogenize התאים על ידי ביצוע משיכות 15 העלים.
23. הוסף 1 נפח המאגר קר כקרח homogenization.
24. העברת spheroplasts הומוגני עד 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפלסטיק.
25. גלולה תאים שלמים, גרעינים, ופסולת רבה על ידי centrifuging דקות 5 XG ב 1500 ב 4 ° C.
26. צנטריפוגה supernatant כתוצאה דקות 5 XG ב 3000 ב 4 ° C.
27. צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 12000 XG ב 4 ° C.
28. למזוג supernatant ו resuspend גלולה במאגר קרים כקרח homogenization [6.5 מ"ל של חיץ / g (משקל רטוב) תאים].
29. צנטריפוגה דקות 5 XG ב 3000 ב 4 ° C.
30. צנטריפוגה supernatant וכתוצאה מכך במשך 15 דקות ב 12000 XG ב 4 ° C.
31. למזוג supernatant ו resuspend גלולה ב 3 מ"ל של חיץ SEM קר כקרח.

** למרות ההשעיה הוא מועשר במיטוכונדריה, הוא מכיל גם אברונים אחרים כגון reticulum endoplasmic (microsomes), Golgi ו vacuoles. כדי לקבל המיטוכונדריה טהור, חלק זה המיטוכונדריה גולמי יכולה להיות נתונה חלוקה נוספת, כמתואר להלן .**

טיהור נטול המיטוכונדריה של זיהום על ידי אברונים אחרים

1. 1.5 מקום מ"ל של 60% קר כקרח (w / v) סוכרוז במאגר EM לתוך צינור Beckman-Ultra Clear צנטריפוגות.
2. כיסוי 60% (w / v) סוכרוז עם 4 מ"ל של 32%, 1.5 מ"ל של 23%, 1.5 מ"ל של סוכרוז 15% (כל חיץ wt / v ב EM).
3. מקום 3 מ"ל של השבר המיטוכונדריה גולמי SEM חיץ מעל 15% (w / v) סוכרוז.
4. צנטריפוגה של רוטור SW41 Beckman מתנדנד-Ti דלי עבור 1 h ב XG 134,000 (33,000 סל"ד) בשעה 4 ° C.
5. צורת המיטוכונדריה שלם להקה חום בממשק / 60% סוכרוז 32%.
6. מוציאים בזהירות סוכרוז עד שהגיע הלהקה המיטוכונדריה.
7. הסר את הלהקה המיטוכונדריה בעזרת פיפטה עם טיפ לחתוך ולמקם אותו לתוך צינור צנטריפוגות Beckman עבור רוטור MLS-5.
8. מלאו את הצינור עם חיץ SEM.
9. גלולה המיטוכונדריה טהור על ידי צנטריפוגה של הרוטור MLS-5 למשך 30 דקות בכל XG 10,000 (31,000 סל"ד) למשך 30 דקות 4 ° C.
10. Supernatant למזוג באמצעותפיפטה.
11. השתמש המיטוכונדריה טהור לניתוח של פונקציות המיטוכונדריה, המיטוכונדריה proteome ו lipidome, ו-DNA המיטוכונדריאלי.

ריאגנטים

1. DTT חוצץ [100 מ"מ Tris/H2SO4 (pH 9.4), 10 mM dithiothreitol] (עבור מ"ל 15)
   • 1.5 מ"ל של חיץ 1 Tris/H2SO4 M (pH 9.4)
   • 150 μl של 1 M DTT
   • נפח עד 15 מ"ל
2. Zymolyase חוצץ [20 mM אשלגן זרחתי (pH 7.4), 1.2 מ 'סורביטול] (עבור 100 מ"ל)
   • 2 מ"ל של 1 חיץ M פוספט אשלגן (pH 7.4)
   • 60 מ"ל של M 2 סורביטול
   • נפח עד 100 מ"ל
3. חיץ homogenization [10 mM טריס / HCl (pH 7.4), 0.6 מ 'סורביטול, 1 mM EDTA, 0.2% (w / v) BSA] (עבור 250 מ"ל]
   • 2.5 מ"ל של טריס 1 M / HCl חיץ (pH 7.4)
   • 75 מ"ל של M 2 סורביטול
   • 500 μl של 500 mM EDTA
   • 0.5 גרם של BSA
   • נפח עד 250 מ"ל
4. SEM חוצץ [10 mM מגבים / KOH (pH 7.2), סוכרוז 250 מ"מ, 1 mM EDTA] (עבור 250 מ"ל)
   • 2.5 מ"ל של 1 מגבים ז / KOH חיץ (pH 7.2)
   • 31.25 מ"ל של סוכרוז M 2
   • 500 μl של 500 mM EDTA
   • נפח עד 250 מ"ל
5. EM חוצץ [10 mM מגבים / KOH (pH 7.2), 1 mM EDTA] (עבור 250 מ"ל)
   • 2.5 מ"ל של 1 מגבים ז / KOH חיץ (pH 7.2)
   • 500 μl של 500 mM EDTA
   • נפח עד 250 מ"ל

Discussion

שיטה זו מאפשרת את הבידוד עתירי יבול של המיטוכונדריה טהור מתאי שמרים. המיטוכונדריה מטוהרים בשיטה זו חופשיים בעיקרו של זיהום על ידי אברונים אחרים ולשמור על השלמות המבנית תפקודית לאחר הטיהור שלהם. השיטה המתוארת התשואות המיטוכונדריה המתאימים הכינון מחדש תאים ללא תהליכ...