Purificación de las mitocondrias de las células de levadura

Resumen

Se describe un método rápido y eficaz para la purificación de las mitocondrias de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Este método permite el aislamiento de alto rendimiento de puro mitocondrias, que son esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos y mantener su integridad estructural y funcional después de su purificación.

Resumen

Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ATP durante el metabolismo aeróbico en eucariotas no fotosintéticos células

Protocolo

Materiales y métodos

Cepas de levadura y las condiciones de crecimiento

La cepa de tipo salvaje BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) fue cultivada en medio rico en YEPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Las células fueron cultivadas a 30 ° C con rotación agitación a 200 rpm en frascos de Erlenmeyer en un "frasco de volumen / volumen medio de" proporción de 5:1.

El aislamiento de la fracción mitocondrial crudo

1. Crecer 1 L de la cultura de la cepa de tipo salvaje BY4742 durante 48 h.
2. Vierta la cultura en 500 ml de tubos de centrifugación Nalgene. Equilibrar la carga de la cosecha y las células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
3. Decantar células sedimentadas sobrenadante y resuspender en 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
4. Decantar células sedimentadas sobrenadante y resuspender en 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
5. Determinar el peso húmedo del sedimento celular.
6. Volver a suspender las células sedimentadas en un tampón de TDT [2 ml de buffer / g (peso húmedo), las células].
7. La transferencia de la suspensión celular a 50 ml tubos de plástico Falcon.
8. Gire los tubos a 70 rpm en un agitador durante 20 min a 30 ° C.
9. Las células de la cosecha por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
10. Volver a suspender las células sedimentadas en tampón Zymolyase sin Zymolyase [7 ml de tampón / g (peso húmedo), las células].
11. Pellet células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente.
12. Volver a suspender las células sedimentadas en tampón Zymolyase sin Zymolyase [7 ml de tampón / g (peso húmedo), las células].
13. Transferencia de suspensión celular a un frasco de vidrio.
14. Añadir el polvo de Zymolyase-100T [1 mg de Zymolyase-100T / g (peso húmedo), las células] a la suspensión celular.
15. Gire el frasco con la suspensión de células a 70 rpm en un agitador durante 30 min a 30 ° C.
16. Esferoplastos transferencia formado debido a la digestión de la pared celular con Zymolyase-100T de 50 ml tubos plásticos de centrífuga.
17. Pellet esferoplastos por centrifugación durante 8 minutos a 2200 xg a 4 ° C.

** Todos los pasos posteriores deben llevarse a cabo a 4 ° C o en hielo. Las suspensiones de esferoplastos deberá ser manejado suavemente con pipetas con las puntas cortadas para evitar romper orgánulos .**

18. Resuspender esferoplastos pellets en tampón de homogeneización helada [6,5 ml de buffer / g (peso húmedo), las células].
19. Pellet esferoplastos por centrifugación durante 8 minutos a 2200 xg a 4 ° C.
20. Resuspender esferoplastos pellets en tampón de homogeneización helada [6,5 ml de buffer / g (peso húmedo), las células].
21. La transferencia de células a un pre-refrigerados en hielo de vidrio homogeneizador.
22. El uso de un mortero apretado, homogeneizar las células, haciendo 15 golpes de la mano del mortero.
23. Añadir 1 volumen de tampón de homogeneización helada.
24. Transferencia de esferoplastos homogeneizada a 50 ml tubos plásticos de centrífuga.
25. Pellet células sin romper, los núcleos y los desechos grandes por centrifugación durante 5 minutos a 1500 xg a 4 ° C.
26. Centrifugar el sobrenadante resultante durante 5 minutos a 3000 xg a 4 ° C.
27. Centrifugar el sobrenadante resultante durante 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
28. Decantar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en helado de tampón de homogeneización [6,5 ml de buffer / g (peso húmedo), las células].
29. Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a 4 ° C.
30. Centrifugar el sobrenadante resultante durante 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C.
31. Decantar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 3 ml de tampón helado SEM.

** A pesar de esta suspensión se enriquece en la mitocondria, que también contiene otros orgánulos como el retículo endoplasmático (microsomas), aparato de Golgi y vacuolas. Para obtener puro mitocondrias, esta fracción mitocondrial crudo puede ser objeto de fraccionamiento adicional, tal como se describe a continuación .**

La purificación de las mitocondrias desprovistas de contaminación por otros orgánulos

1. Coloque 1,5 ml de helado de 60% (w / v) de sacarosa en tampón de EM en un tubo de centrífuga Beckman ultra claro.
2. Superposición del 60% (w / v) de sacarosa con 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de 15% de sacarosa (todos buffer p / v en EM).
3. Colocar 3 ml de la fracción mitocondrial crudo en el SEM de amortiguación en la parte superior del 15% (w / v) de sacarosa.
4. Centrífuga en un Beckman SW41 Ti pivotar-Rotor durante 1 hora a 134.000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C.
5. La forma de la mitocondria intacta una banda de color marrón en el 60% / interfaz de sacarosa del 32%.
6. Retire con cuidado sacarosa hasta llegar a la banda mitocondrial.
7. Retire la banda mitocondrial utilizando una pipeta con una punta corta y colóquela en un tubo de centrífuga Beckman de la MLS-5 rotor.
8. Llenar el tubo con tampón SEM.
9. Pellet de las mitocondrias puro por centrifugación en un rotor MLS-5 durante 30 minutos a 10.000 xg (31.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C.
10. Sobrenadante se decanta conuna pipeta.
11. Utilice el puro mitocondrias para el análisis de las funciones mitocondriales, y proteoma mitocondrial lipidome, y el ADN mitocondrial.

Reactivos

1. TDT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitol] (por 15 ml)
   • 1,5 ml de 1 M de tampón Tris/H2SO4 (pH 9,4)
   • 150 ml de 1 M de TDT
   • Volumen de 15 ml
2. Buffer Zymolyase [20 mM fosfato de potasio (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (por 100 ml)
   • 2 ml de una solución amortiguadora de fosfato de potasio M (pH 7,4)
   • 60 ml de 2 M de sorbitol
   • Volumen de 100 ml
3. Tampón de homogeneización [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (por 250 ml]
   • 2,5 ml de 1 M Tris / HCl buffer (pH 7,4)
   • 75 ml de 2 M de sorbitol
   • 500 l de 500 mM EDTA
   • 0,5 g de BSA
   • Volumen de 250 ml
4. SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de sacarosa, 1 mM EDTA] (por 250 ml)
   • 2,5 ml de 1 M MOPS / KOH (pH 7.2)
   • 31,25 ml de 2 M de sacarosa
   • 500 l de 500 mM EDTA
   • Volumen de 250 ml
5. EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (por 250 ml)
   • 2,5 ml de 1 M MOPS / KOH (pH 7.2)
   • 500 l de 500 mM EDTA
   • Volumen de 250 ml

Discusión

Este método permite el aislamiento de alto rendimiento de puro mitocondrias de células de levadura. Las mitocondrias purificadas por este método son esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos y mantener su integridad estructural y funcional después de su purificación. El método descrito mitocondrias rendimientos que son adecuados para células libres de la reconstitución de los procesos esenciales mitocondrial. Estas mitocondrias de alta pureza también se puede utilizar para el análisis de la e...