Purificação de mitocôndrias de células de levedura

Resumo

Nós descrevemos um método rápido e eficaz para a purificação de mitocôndrias da levedura Saccharomyces cerevisiae. Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro que são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação.

Resumo

As mitocôndrias são o principal local de produção de ATP durante o metabolismo aeróbico em eucariotas não fotossintéticos células

Protocolo

Materiais e métodos

Cepas de leveduras e condições de crescimento

A cepa do tipo selvagem BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) foi cultivado em meio YEPD rica (1% extrato de levedura, peptona 2%, 2% de glicose). Células foram cultivadas a 30 ° C com rotação agitação a 200 rpm em Erlenmeyers em um "volume frasco de volume / médio" proporção de 5:1.

Isolamento da fração mitocondrial crude

1. Crescer 1 L da cultura BY4742 tipo selvagem tensão por 48 h.
2. Despeje cultura em 500 ml tubos de centrífuga Nalgene. Equilibrar a carga e células de colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
3. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
4. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células peletizadas em 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
5. Determinar o peso úmido de pellet celular.
6. Ressuspender as células peletizada na TDT buffer [2 ml de células (peso úmido) buffer / g].
7. Transferir a suspensão de célula para 50 ml, tubos de plástico Falcon.
8. Girar os tubos a 70 rpm em um agitador por 20 min a 30 ° C.
9. Células colheita por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
10. Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g].
11. Pellet células por centrifugação por 5 min a 3000 xg à temperatura ambiente.
12. Ressuspender as células em tampão Zymolyase peletizadas sem Zymolyase [7 ml de células (peso úmido) buffer / g].
13. Transferência de suspensão de células para um balão de vidro.
14. Adicionar o pó de Zymolyase-100T [1 mg de células (peso úmido) Zymolyase-100T / g] para a suspensão de células.
15. Gire o frasco com suspensão de células em 70 rpm em um agitador por 30 min a 30 ° C.
16. Esferoplastos transferência formado devido à digestão da parede celular com Zymolyase-100T de 50 ml, tubos de centrífuga de plástico.
17. Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C.

** Todas as etapas subseqüentes devem ser realizados a 4 ° C ou em gelo. Suspensões de esferoplastos devem ser manuseados com cuidado usando pipetas com pontas cortadas para evitar a quebra organelas .**

18. Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g].
19. Pellet esferoplastos por centrifugação por 8 min a 2200 xg, a 4 ° C.
20. Ressuspender esferoplastos peletizada na gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g].
21. Transferência de células para um pré-refrigeradas em gelo copo homogeneizador.
22. Usando um pilão apertado, homogeneizar as células, fazendo 15 batidas do pilão.
23. Adicionar um volume de gelada tampão de homogeneização.
24. Transferência esferoplastos homogeneizada a 50 ml tubos de centrífuga de plástico.
25. Pellet as células intactas, núcleos e partículas grandes por centrifugação por 5 min a 1500 xg, a 4 ° C.
26. Centrifugar o sobrenadante resultante para 5 min a 3000 xg, a 4 ° C.
27. Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C.
28. Decantar o sobrenadante e ressuspender em pellet gelada tampão de homogeneização [6,5 ml de células (peso úmido) buffer / g].
29. Centrifugar por 5 min a 3000 xg, a 4 ° C.
30. Centrifugar o sobrenadante por 15 min a 12000 xg, a 4 ° C.
31. Decantar o sobrenadante e ressuspender pellet em 3 ml de gelado de buffer SEM.

** Embora esta suspensão é enriquecido na mitocôndria, que também contém outras organelas como o retículo endoplasmático (microssomos), Golgi e vacúolos. Para obter a mitocôndria pura, esta fração de petróleo mitocondrial pode ser submetido a fracionamento ainda, conforme descrito abaixo .**

Purificação de mitocôndrias desprovida de contaminação por outras organelas

1. Ml lugar de 1,5 gelada 60% (w / v) de sacarose na EM tampão em um tubo de centrífuga Beckman Ultra-Clear.
2. Sobreposição de 60% (w / v) de sacarose, com 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de sacarose 15% (todos tampão wt / v em EM).
3. Coloque 3 ml da fração mitocondrial em bruto SEM tampão em cima de 15% (w / v) de sacarose.
4. Centrífuga em uma Ti SW41 rotor Beckman balançando-balde por 1 hora a 134.000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C.
5. A mitocôndria forma intacta uma faixa marrom na interface de sacarose 60% / 32%.
6. Remova cuidadosamente sacarose até chegar a banda mitocondrial.
7. Retire a banda mitocondrial utilizando uma pipeta com uma ponta de corte e colocá-lo em um tubo de centrífuga Beckman para um rotor-5 MLS.
8. Encha o tubo com tampão de SEM.
9. Pellet as mitocôndrias pura por centrifugação em um rotor MLS-5 para 30 min a 10.000 xg (31.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C.
10. Decantar o sobrenadante usandouma pipeta.
11. Use as mitocôndrias pura para a análise de funções mitocondriais, proteoma mitocondrial e lipidome e DNA mitocondrial.

Reagentes

1. TDT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitol] (para 15 ml)
   • 1,5 ml de um tampão Tris/H2SO4 M (pH 9,4)
   • 150 mL de 1 M DTT
   • Volume para 15 ml
2. Zymolyase tampão [20 mM fosfato de potássio (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (para 100 ml)
   • 2 ml de um tampão fosfato de potássio M (pH 7,4)
   • 60 ml de 2 M sorbitol
   • Volume de 100 ml
3. Tampão de homogeneização [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (para 250 ml]
   • 2,5 ml de 1 M Tris / HCl (pH 7,4)
   • 75 ml de 2 M sorbitol
   • 500 mL de 500 mM EDTA
   • 0,5 g de BSA
   • Volume para 250 ml
4. SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de sacarose, 1 mM EDTA] (para 250 ml)
   • 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2)
   • 31,25 ml de 2 M de sacarose
   • 500 mL de 500 mM EDTA
   • Volume para 250 ml
5. EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (para 250 ml)
   • 2,5 ml de 1 MOPS M / buffer KOH (pH 7,2)
   • 500 mL de 500 mM EDTA
   • Volume para 250 ml

Discussão

Este método permite o isolamento de alto rendimento de mitocôndrias puro de células de levedura. Mitocôndrias purificadas por esse método são essencialmente livres de contaminação por outras organelas e manter sua integridade estrutural e funcional após a sua purificação. O método descrito rendimentos mitocôndrias, que são adequados para células livres reconstituição de processos essenciais mitocondrial. Estas mitocôndrias altamente puro pode também ser usado para a análise da estrutura mitocondrial ...