Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine schnelle und effektive Methode zur Aufreinigung von Mitochondrien aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien, die im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen sind und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind die Haupt-Website des ATP-Produktion im aeroben Stoffwechsel in eukaryotischen Zellen nicht-photosynthetischen

Protokoll

Material und Methoden

Hefestämme und Wachstumsbedingungen

Der Wildtypstamm BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) wurde in den reichen YEPD Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose). Die Zellen wurden bei 30 ° C mit Rotations-Schütteln bei 200 rpm in Erlenmeyer-Kolben bei einer "Flasche Volumen / Medium Volume"-Verhältnis von 5:1 kultiviert.

Isolation von Roh-mitochondriale Fraktion

1. Grow 1 L der Wildtypstamm BY4742 Kultur für 48 h
2. Gießen Kultur in 500-ml Nalgene Zentrifugenröhrchen. Balance der Last und Ernte Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
3. Dekantieren Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 250 ml dH2O. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
4. Dekantieren Überstand und resuspendieren pelletierten Zellen in 250 ml dH2O. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
5. Bestimmen Sie Nassgewicht Zellpellet.
6. Resuspendieren pelletierten Zellen in DTT-Puffer [2 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen].
7. Übertragen Sie die Zellsuspension auf 50-ml Falcon Rohre aus Kunststoff.
8. Drehen Sie das Röhrchen bei 70 rpm in einem Schüttler für 20 min bei 30 ° C.
9. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
10. Resuspendieren pelletierten Zellen in Zymolyase Puffer ohne Zymolyase [7 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen].
11. Pellet-Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 3000 xg bei Raumtemperatur.
12. Resuspendieren pelletierten Zellen in Zymolyase Puffer ohne Zymolyase [7 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen].
13. Transfer-Zell-Suspension in einem Glaskolben.
14. Fügen Sie die Pulver von Zymolyase-100T [1 mg Zymolyase-100T / g (Feuchtgewicht) Zellen], um die Zell-Suspension.
15. Drehen Sie den Kolben mit Zellsuspension bei 70 rpm in einem Schüttler für 30 min bei 30 ° C.
16. Transfer Sphäroplasten gebildet durch die Verdauung der Zellwand mit Zymolyase-100T bis 50-ml Kunststoff-Röhrchen.
17. Pellet Sphäroplasten durch Zentrifugation für 8 min bei 2200 xg bei 4 ° C.

** Alle weiteren Schritte sollten bei 4 ° C oder auf Eis durchgeführt werden. Suspensionen von Sphäroplasten sollten schonend behandelt, mit Pipetten mit geschnittenen Spitzen zu vermeiden brechen Organellen werden .**

18. Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen].
19. Pellet Sphäroplasten durch Zentrifugation für 8 min bei 2200 xg bei 4 ° C.
20. Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen].
21. Transfer-Zellen zu einer pre-auf Eis gekühlt Glashomogenisator.
22. Mit einer engen Pistill Homogenisierung der Zellen, indem sie 15 Schläge von dem Pistill.
23. Add 1 Volumen eiskaltem Homogenisierungspuffer.
24. Transfer homogenisiert Sphäroplasten bis 50-ml Kunststoff-Röhrchen.
25. Pellet ungebrochene Zellen, Kerne und große Trümmer durch Zentrifugation für 5 min bei 1500 xg bei 4 ° C.
26. Centrifuge der resultierende Überstand für 5 min bei 3000 xg bei 4 ° C.
27. Centrifuge der resultierende Überstand für 15 min bei 12000 xg bei 4 ° C.
28. Dekantieren und Pellet in eiskaltem Homogenisierungspuffer [6,5 ml Puffer / g (Feuchtgewicht) Zellen].
29. Zentrifugieren Sie für 5 min bei 3000 xg bei 4 ° C.
30. Centrifuge der resultierende Überstand für 15 min bei 12000 xg bei 4 ° C.
31. Dekantieren und Pellet in 3 ml eiskaltem SEM-Puffer.

** Obwohl diese Suspension in den Mitochondrien angereichert ist, es enthält auch andere Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (Mikrosomen), Golgi und Vakuolen. Um reine Mitochondrien, können diese rohe mitochondriale Fraktion zur weiteren Fraktionierung unterworfen werden, wie unten beschrieben .**

Reinigung von Mitochondrien ohne Verunreinigung durch andere Organellen

1. Legen Sie 1,5 ml eiskaltem 60% (w / v) Saccharose in EM-Puffer in ein Beckman Ultra-Clear-Zentrifugenröhrchen.
2. Overlay 60% (w / v) Saccharose mit 4 ml 32%, 1,5 ml von 23%, 1,5 ml 15% Saccharose (alle wt / v in EM-Puffer).
3. Platz 3 ml des Roh-mitochondriale Fraktion in SEM-Puffer auf 15% (w / v) Saccharose.
4. Zentrifuge in einem Beckman SW41 Ti Ausschwingrotor Rotor für 1 h bei 134000 xg (33000 rpm) bei 4 ° C.
5. Die intakten Mitochondrien bilden ein braunes Band an der 60% / 32% Saccharose-Schnittstelle.
6. Entfernen Sie vorsichtig Saccharose bis zum Erreichen der mitochondrialen Band.
7. Entfernen Sie die mitochondriale Band mit einer Pipette mit einem Cut-Spitze und legen Sie sie in ein Beckman Zentrifugenröhrchen für ein MLS-5 Rotor.
8. Füllen Sie das Rohr mit SEM-Puffer.
9. Pellet der reinen Mitochondrien durch Zentrifugation in einem MLS-5-Rotor für 30 min bei 10000 xg (31000 rpm) für 30 Minuten bei 4 ° C.
10. Dekantieren Überstand miteiner Pipette.
11. Verwenden Sie die reine Mitochondrien für die Analyse der mitochondrialen Funktionen, mitochondriale Proteom-und lipidome, und die mitochondriale DNA.

Reagenzien

1. DTT-Puffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM Dithiothreitol] (für 15 ml)
   • 1,5 ml 1 M Tris/H2SO4 Puffer (pH 9,4)
   • 150 ul 1 M DTT
   • Volume auf 15 ml
2. Zymolyase Puffer [20 mM Kaliumphosphat (pH 7,4), 1,2 M Sorbitol] (für 100 ml)
   • 2 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,4)
   • 60 ml 2 M Sorbit
   • Volumen auf 100 ml
3. Homogenisierungspuffer [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M Sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (für 250 ml]
   • 2,5 ml 1 M Tris / HCl-Puffer (pH 7,4)
   • 75 ml 2 M Sorbit
   • 500 ul 500 mM EDTA
   • 0,5 g BSA
   • Volume auf 250 ml
4. SEM-Puffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM Saccharose, 1 mM EDTA] (für 250 ml)
   • 2,5 ml 1 M MOPS / KOH-Puffer (pH 7,2)
   • 31,25 ml 2 M Saccharose
   • 500 ul 500 mM EDTA
   • Volume auf 250 ml
5. EM-Puffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (für 250 ml)
   • 2,5 ml 1 M MOPS / KOH-Puffer (pH 7,2)
   • 500 ul 500 mM EDTA
   • Volume auf 250 ml

Diskussion

Dieses Verfahren ermöglicht die High-Yield-Isolierung reiner Mitochondrien aus Hefezellen. Mitochondrien mit dieser Methode gereinigt sind im Wesentlichen frei von Verunreinigungen durch andere Organellen und behalten ihre strukturelle und funktionelle Integrität nach ihrer Reinigung. Die beschriebene Methode liefert Mitochondrien, die sich für zellfreie Rekonstitution wesentlicher mitochondriale Prozesse sind. Diese hochreinen Mitochondrien können auch für die Analyse der mitochondrialen Struktur und Funktionen, m...