خالية من التحديد التمهيدي Aptamer باستخدام مكتبة DNA عشوائية

Summary

سيليكس بروتوكولات تشمل جولات متعددة من الاختيار ، كل منها تتطلب تجديد يغاندس ملزمة ، وهذا بدوره يتطلب تسلسل التمهيدي ثابتة في المناطق المحيطة مكتبة عشوائي. يمكن لهذه التسلسلات التمهيدي الثابتة تتداخل مع عملية التحديد (كاذبة ايجابيات وسلبيات). هنا نقدم التمهيدي خالية من البروتوكول.

Abstract

[أليغنوكليوتيد] الأبتامرات ومنظم للغاية (DNA أو RNA) التي يمكن ربط الصلات مع أهداف مماثلة لأجسام مضادة ^1. يتم تحديدها من خلال عملية انتقاء في المختبر يسمى التطور المنهجي للتخصيب بواسطة يغاندس الأسي (سيليكس) إلى التعرف على تشكيلة واسعة من الأهداف ، من جزيئات صغيرة على البروتينات والجزيئات الأخرى ^2-4. الأبتامرات والخصائص التي هي مناسبة تماما للتشخيص في الجسم الحي و / أو التطبيقات العلاجية : وبالاضافة الى نوعية جيدة وتقارب ، تم تجميعها بسهولة ، البقاء في ظروف تجهيز أكثر صرامة ، فهي مناعة ضعيفة ، وصغر حجمها نسبيا يمكن أن تؤدي إلى اختراق من السهل الأنسجة.

الأبتامرات التي يتم تحديدها من خلال عملية سيليكس القياسية تشمل عادة ~ 80 النيوكليوتيدات (NT) ، حيث عادة ما يتم اختيار هؤلاء من مكتبات الحمض النووي مع ~ 40 مناطق العشوائية NT طويلة بالاضافة الى المواقع الثابتة للNT التمهيدي 20 ~ على كل جانب. تسلسل التمهيدي ثابتة وبالتالي يمكن أن تشمل ما يقرب من 50 ٪ من ~ تسلسل المكتبة ، وبالتالي قد سلبا أو إيجابا سطا تحديد الأبتامرات في عملية الاختيار ³ ، على الرغم من أن النهج المعلوماتية الحيوية تشير إلى أن تسلسل ثابت لا تساهم بشكل كبير في هيكل aptamer بعد اختيار ⁵ . لمعالجة هذه المشاكل المحتملة ، وقد تم حظر متواليات التمهيدي من قبل [أليغنوكليوتيد] تكميلية أو تحول إلى سلاسل مختلفة في منتصف الطريق خلال جولات سيليكس ⁶ ، أو تم قطع عليهم 6-9 NT ^{7 و 8.} ون جيا باو ورمادي ⁹ تصميم التمهيدي خالية من الأسلوب سيليكس الجينومية ، والتي أزيلت تماما تسلسل التمهيدي من المكتبة قبل الاختيار وكانت مجدد ثم السماح التضخيم من شظايا الجينومية المحدد. ومع ذلك ، لاستخدام هذه التقنية ، ومكتبة فريدة من نوعها الجينومية أن يتم بناؤها ، والتي تمتلك التنوع محدودة ، وتجديدها بعد جولات من الاختيار يعتمد على خطوة reamplification الخطية. بدلا من ذلك ، واجتمعت الجهود لتجاوز مشكلات الناجمة عن تسلسل التمهيدي الثابتة باستخدام تقسيم عالية الكفاءة مع المشاكل المتعلقة PCR التضخيم ^10.

قمنا بتطوير التمهيدي خالية طريقة الاختيار (الجبهة الوطنية) التي تبسط الإجراءات بشكل كبير سيليكس ويزيل بفعالية التمهيدي التدخل مشاكل ^{11 و 12.} بروتوكولات العمل بطريقة مباشرة. يتم تنقية المنطقة الوسطى عشوائية من المكتبة دون تسلسل دخيلة واقية ومنضما الى هدف مناسب (على سبيل المثال إلى البروتين النقي أو مخاليط معقدة مثل خطوط الخلية). ثم يتم الحصول على تسلسل محدد ، لم شملهم مع تسلسل المرافقة ، وإعادة تضخيم لتوليد فرعية مختارة المكتبات. كمثال على ذلك ، اختارت نحن هنا لالأبتامرات S100B ، علامة البروتين لسرطان الجلد. وأظهرت فحوصات ملزمة دينار في ق (10) ^و-7 -- 10 ^-8 M مجموعة بعد بضع جولات من الاختيار ، وعلينا أن نظهر أن الأبتامرات العمل بفعالية في شكل شطيرة ملزمة.

Protocol

1. وصف موجز للالتمهيدي خالية من البروتوكولات التحديد

شيد مكتبة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل باستخدام PCR مع [أليغنوكليوتيد] المقابلة (Figure1 و 2 ، الخطوة أ) ، التي تحتوي على نطاق وسط عشوائية من 30 الشمالي ، ويحيط بها مناطق التمهيدي اثنين. وقد وضعت اثنين من مختلف قليلا "التمهيدي خالية" (PF) البروتوكولات. في مكتبة dsDNA ، 5' - المنطقة تحتوي على نوكلياز داخلية "الخدش" موقع لNt.BstNBI نوكلياز داخلية ، وهذا الانزيم يتعرف dsDNA لكن يشق احد فقط حبلا من الركيزة الحمض النووي. 3' المنطقة ، من مكتبة تحتوي dsDNA آخر "الخدش" الموقع ، لNt.BbvCI نوكلياز داخلية يعترف أيضا dsDNA لكن يشق حبلا واحدة فقط ، وترك في 3'end CC (PF ₁₎ ، فضلا عن BspMI a نوكلياز داخلية موقع التقييد ، والتي يشق على حد سواء ترك فروع إضافية النيوكليوتيدات رقم 3 "(PF _2). نحن نوظف عموما PF ₁ بروتوكول البداية (لأن أسهل لشظايا منفصلة أنتجت خلال عملية الاختيار ، وانظر أدناه) ، ومن ثم توظيف PF ₂ بروتوكول لجولات لاحقة من التحديد.

تم إنشاؤها على التوالي NT 32 من "جزء (المسمى + 32 - FRAGMENT) والإقليم الشمالي 30 من 5' - pN30 - 3' 5' - pN30 - CC - 3 قطعة (30 + المعينة ، جزء) من قبل Nt.BbvCI / NT . BstNBI أو BspMI / Nt.BstNBI تشطر من المكتبة dsDNA ، وهلام التطهير. 32 + - جزء يحتوي على مجال Windows NT 30 عشوائية ، مع تسلسل CC المرافقة في نهاية 3' - (PF _1). في 30 + - FRAGMENT (PF ₂₎ يتكون فقط في 30 NT تسلسل المجال عشوائي. وتم الحصول على قطعة (الذي يحتوي على منطقة عشوائية N30 مع 5 'و3' متواليات المرافقة) عن طريق تنقية هلام (Nt.BbvCI أو Nt.BstNBI تخفيضات العلوي فقط "+" حبلا) -- "النفس جسر" 66. يتم الحصول على هذا الجسر مباشرة الذاتي في البروتوكول ₁ PF ، أو يمكن أن تتولد ومعزولة بعد قطع الحمض النووي مع مكتبة NtBbv.CI Nt.BstNBI فقط أو للبروتوكول ₂ PF (الشكل 1 و 2 الخطوة ب ،). وحضنت أو 32 + - شظايا مع البروتينات المنقى أو خلايا سرطان الجلد مثقف للسماح للشظايا ربط البروتينات أو الخلايا ، ومن ثم تم غسلها بعيدا شظايا غير منضم (الشكل 1 و 2 ، ج الخطوة) -- 32 +. استخدمت شظايا ملزمة أو تحديد لتوليد إعادة المناطق التمهيدي.

في رد فعل تهجين / الربط ، تم إنتاج الذاتي الجسر وتنقيتها في الوقت نفسه 32 + -- 30 + ، وجزء تنقية ؛ 5' نهاية التمهيدي وكان نفس بناء مكتبة واستعيض 3' نهاية الاشعال مع مطابقة الاشعال التي تتضمن أيضا مبلغا إضافيا المروج النسخ SP6 في نهاية 3' (الشكل 1 و 2 ، د الخطوة). ثم استخدمت هذه المنتجات من رد فعل تهجين / لربط المختبر في النسخ RNA (الشكل 1 و 2 ، الخطوة ه). بعد نسخ الحمض النووي الريبي ، وهضم ligated السلطات الوطنية المعينة (بما في ذلك جزء غير محدد الحمض النووي الذاتي جسر) التي الدناز الأول لإزالة خلفية تسلسل التدخل. أظهرت النسخ العكسي (RT) - PCR البيانات التي تم reamplified بكفاءة التمهيدي - مجدد المنتجات ، والتي تشكل "جولة" لاختيار (الشكل 1 و 2 ، و الخطوة). يمكن أن تكون الخلفية معروضة في تضخيم الأرقام دورة عالية في التحكم PCR - RT ليس ازالتها بالكامل عن طريق الهضم إضافية الدناز أنا ، وليس بعد اكتشاف دورة بأعداد أقل ، والتي نستخدمها بشكل روتيني.

بعد 7 جولات من الاختيار ، وتميزت الأبتامرات لخصائص ملزمة. وكان دك كل في نطاق M 10 ^-7 10 ^-8 (الشكل 3). في المقايسات ملزمة ، وأظهرت أزواج مختلفة من الأبتامرات ملزمة المضافة ، مشيرا إلى أنها تستهدف مواقع متميزة على البروتين S100B. اختبرنا ذلك في أزواج من الأبتامرات المقايسات "شطيرة" ملزمة ، سواء على ميكروأرس الزجاج (شرائح Codelink) باستخدام الأبتامرات second fluorescently الموسومة ، وعلى أسلاك الذهب derivatized مع الأبتامرات second بالإضافة إلى 50 نانومتر الذهب النانوية (AuNPs ؛ الشكل 3). في كلتا الحالتين ، كان ملزما خصوصية عالية : في ميكروأرس Codelink ، لوحظ عدم الربط مع شطيرة الأبتامرات التي لم تظهر في قرارات ملزمة المضافة دينار كويتي. مع أسلاك derivatized احظنا عمليا أي ملزم لغير المستهدفة والبروتينات ، ويمكن ملاحظة المجمعات شطيرة الفردية عبر AuNPs aptamer - يقترن (الشكل 3).

2. المواد

2.1. جيل من الحمض النووي الجبهة الوطنية ومكتبة Reamplification من شظايا منضم

موصوفة في التفاصيل وعموم كلوسون ، 2009 ؛ عموم وآخرون ، 2008.

2.2. اختيار تنقية البروتين واستنادا

1. 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4
2. 32 + ، و 30 قطعة + - FRAGMENT
3. الاحتياطي اختيار (2.5 ملي CaCl ₂ ، 5 مم ₂ في MgCl 1X الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، ودرجة الحموضة 7.4 ، Gibco)
4. NI - NTA الخرز Agarose (Qiagen)
5. العمود البولي بروبلين (Qiagen)
6. الربط الاحتياطي (50 ملي نا ₂هبو ₄ - ناه ₂ ص ₄ ، pH7.2 ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم)
7. وأعرب ، في تنقية البروتين S100B الاحتياطي ملزم (5 ميكروغرام / ميكرولتر)
8. الفينول : ChCl3 : IAA (7.9 درجة الحموضة ، Ambion)
9. 3 M NaAc ، ودرجة الحموضة 5.2
10. 100 ٪ ، والايثانول 70 ٪

2.3. TOPO الاستنساخ وتحليل التسلسل الجيني للمكتبات dsDNA مختارة

1. 7 الجولة ^ال PCR المنتجات المختارة (لا يمكن أن يؤديها جولات إضافية لمواصلة التحسين من aptamer ملزم)
2. pCR2.1 - TOPO المتجهات (Invitrogen)
3. الخلايا المكونة ل Dh5 (Invitrogen)
4. البلازميد ميني كيت (Qiagen)
5. M13 التمهيدي إلى الأمام
6. Informax لناقلات NTI (Invitrogen)

2.4. ملزمة خصائص الأبتامرات

1. الأبتامرات والسيطرة oligos (N و N ₃₀ CC ₃₀ ، IDT)
2. T4 كيناز عديد النوكليوتيد (نيو إنجلاند Biolabs)
3. γ - ³² - P ATP (3000 تسى / ملمول ؛ μCi 10 / مل)
4. تنقية S100B في الاحتياطي ملزم (5 ميكروغرام / ميكرولتر)

2.5. فحوصات شطيرة ملزم مع بروتين منقى وS100B الأبتامرات مختارة

1. وقد اقترنت 1 ^ش aptamer إما أ) Codelink الشرائح ميكروأري أو ب) أسلاك الاتحاد الافريقي.
2. تنقية S100B البروتين ، والمخفف لميكرومتر 0،125 إما في 70 ميكرولتر ل) أو 1 ميكرومتر في 50 ميكرولتر لب).
3. ^{والثانية} (2) والمسمى إما مع aptamer أ) Alexafluor 546 لمجموعة الشرائح Codelink ، أو ب) بالإضافة إلى 50 نانومتر AuNPs للدراسات مع أسلاك derivatized الاتحاد الافريقي.

3. طرق

3.1. جيل من الحمض النووي مكتبة PF

يمكن العثور على طرق مفصلة وبروتوكولات لاختيار aptamer في عموم وكلوسون ، 2009 ؛ عموم وآخرون ، 2008.

3.2. Aptamer التحديد باستخدام بروتين منقى S100B

وقد استخدم الإنسان S100 الكالسيوم ملزمة ب البروتين (الجينات S100B. رقم # 6285) كهدف. أعرب عن صاحب البروتين S100B ₆ الموسومة (98 الأحماض الأمينية في الطول) وتنقيته من خلال استخدام نظام QIAexpressionist. (QIAGEN). إذا رغبت في ذلك ، أو أشارت ، يمكن إزالة صاحب العلامة ₆ إنزيمي. خلال جولات من التحديد ، تم حفظ العينة 1 ميكرولتر من كل خطوة لالتلألؤ السائل الفرز لتحديد الكفاءة العامة ملزمة.

3.2.1. إعداد مكتبة شظايا الدنا PF

1. إعادة تعليق ⁺ 32 ⁺ 30 وشظايا في 40 ميكرولتر من 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4.
2. 3 دقائق على حرارة 85 درجة مئوية ، ويبرد إلى 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق في حاضنة من 37 درجة مئوية.
3. إضافة ميكرولتر 760 من اختيار العازلة (2.5 ملي CaCl ₂ ، 5 مم ₂ في MgCl 1X الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، ودرجة الحموضة 7.4 ، GIBCO) ، واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية ، والحفاظ على درجة حرارة الغرفة ثم (RT) لمدة 10 دقيقة.
4. تمر عبر عمود الواردة ني NTA - agarose الخرز (QIAGEN) قبل غسلها العازلة الاختيار ، ثم في الاحتفاظ RT حتى الاستخدام.

3.2.2. إعداد S100B Agarose - الخرزة ني NTA منضم في RT

1. تدور بانخفاض 400 ميكرولتر من الخرز agarose ني لمدة 3 ثوانى NTA وتجاهل طاف.
2. تغسل حبات مع 400 ميكرولتر من العازلة ملزمة (50 ملي نا ₂ هبو ₄ - ناه ₂ ص ₄ ، pH7.2 ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم) من قبل pipetting بلطف 5 مرات ، وتدور ثم إلى أسفل وتجاهل طاف.
3. كرر الخطوة 2 مرتين.
4. إضافة 400 ميكرولتر من S100B المنقى (5 ميكروغرام / ميكرولتر ، علقت في المخزن ملزمة) ، وبلطف ماصة 5 مرات كل 3 دقائق عن ما مجموعه 15 دقيقة.
5. تدور أسفل وتجاهل طاف.
6. غسل S100B حبة محدد مع 400 ميكرولتر من العازلة ملزمة pipetting بلطف 3 مرات ، ثم تدور إلى أسفل وتجاهل طاف.
7. كرر الخطوة 6 مرتين.

3.2.3. اختيار S100B متجهة الأبتامرات

1. نقل + 32 -- و 30 + - شظايا من 3.2.1 إلى S100B حبة محدد.
2. احتضان لمدة 15 دقيقة ومزيج بلطف كل 3 دقائق بواسطة pipetting بلطف.
3. غسل معقدة S100B الدنا مع 800 ميكرولتر من العازلة ملزمة pipetting بلطف ، ثم تدور إلى أسفل وتجاهل طاف.
4. كرر الخطوة 3 مرتين.

3.2.4. انتعاش الأبتامرات S100B مختارة

1. إضافة 200 ملي 20 ميكرولتر تريس ، حمض الهيدروكلوريك (pH7.4) ، والحرارة في 3 دقائق و 85 درجة مئوية ، دوامة 1 دقيقة ، وتدور إلى أسفل ، ثم نقل إلى طاف أنبوب جديد.
2. كرر الخطوة 1 مرة واحدة ، والجمع بين supernates.
3. تنقية تحديد الحمض النووي شظايا باعتبارها خطوات في 12/09 من المنشورات السابقة (11 ، 12).

3.2.5. TOPO الاستنساخ وتحليل التسلسل الجيني لتحديد متواليات Aptamer توافق

1. استنساخ الجولة ^ال 10 المختارة المنتجات PCR في pCR2.1 TOPO النواقل (من Invitrogen). إضافيويمكن أن يتم استنساخ كما يتم تنفيذ المزيد من التحديدات.
2. تسلسل 40-50 المستعمرات واحد مع M13 التمهيدي امام (نستخدم الأساسية مرفق الوراثة الجزيئية في المركز الطبي هيرشي).
3. محاذاة تسلسل المحدد باستخدام Informax لناقلات NTI (Invitrogen).
4. تحديد تسلسل إجماع عالمي قائم على التحالفات.
5. ثم تم شراؤها الأبتامرات الآراء من تقنيات الحمض النووي المتكامل.

3.3. فحوصات شطيرة ملزم مع أزواج الأبتامرات مختارة

3.3.1. ميكروأري تنسيق باستخدام fluorescently المسمى الأبتامرات ^{الثانية} 2.

1. وكانت الآراء توليفها 1 ^ش الأبتامرات مع شاردة 5' - amineC6. تم وقفها في المخزن المؤقت الطباعة إلى التركيز النهائي من 15 ميكرومتر ورصدت على الشرائح المنشط Codelink (GE للرعاية الصحية / العلوم البيولوجية أمرشام) باستخدام Apogent الاكتشافات MicroGrid Arrayer الحمض النووي في منشأة ميكروأري PSU ، جامعة بارك) ، في أعقاب بروتوكولات Codelink الموصى بها. وقد طبع كل شريحة مع 12 المصفوفات.
2. وقد أجريت في التهجين من 2 × 8 شكل كاسيت تهجين ميكروأري (صفيف و، TeleChem الدولية). وختم كاسيت ميكروأري باستخدام nuclease خالية من احباط الختم لاصق (AlumaSeal الثاني ، بحوث المنتجات الدولية) لمنع التبخر.
3. وكان المخفف S100B البروتين في برنامج تلفزيوني للتركيز في 70 ميكرولتر المناسبة وتطبيقها على آبار كاسيت ميكروأري. وكان ملزما للالأبتامرات المطبوعة على الشريحة Codelink لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ثم كانت الآبار من الكاسيت غسلها بشكل فردي مع 3X + PBS MgCl 5 مم ₂ (PBSM) ، وكان الفائض عازلة نشف الغسيل. وقد تضعف الأبتامرات fluorescently المسمى في PBSM إلى 0.125 ميكرومتر في 70 ميكرولتر ، ومن ثم تسخينها إلى 85 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 3 دقائق على الجليد. طبقت الأبتامرات إلى آبار كاسيت ميكروأري ، وحضنت لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. ومرة أخرى الآبار غسلها بشكل فردي مع PBSM 3X. لقد التقطت ثم الكاسيت إربا ، وكان الإعلان تشطف الشريحة بأكملها في PBSM. ثم كانت الشريحة تجفف جيدا بواسطة الطرد المركزي ، ومسحها باستخدام المسح الضوئي باكارد العلوم البيولوجية ScanArray 4000XL (بيركن إلمر).

3.3.2. Derivatized شكل أسلاك متناهية الصغر باستخدام الأبتامرات ^{الثانية} 2 بالإضافة إلى 50 نانومتر AuNPs

وتوليفها الذهب NWS (~ 5 ميكرومتر في الطول ، 320 نانومتر في القطر) التي galvanostatic الكهربي داخل أغشية مسامية الألومينا البروتوكولات التالية المنشورة سابقا (13 ، 14). عند انحلال الغشاء يسهل اختراقها ، ومعلق أسلاك في 1 مل ايثانول.

كما لاحظنا ، تم شراؤها من الحمض النووي من تقنيات الحمض النووي المتكامل. وقد تم شراء الذهب النانوية (50 نانومتر) من بيلا تيد. وكان المشقوق الحمض النووي مع Thiolated DTT 100 ملم في 0.1 درجة الحموضة فوسفات الصوديوم M 8.3 لمدة ساعة ثم تنقيته في العمود 10 Centri الجانبية.

Aptamer التعلق NWS الذهب وNPS

وكان يوضع قسامة 50 ميكرولتر من أسلاك الاتحاد الافريقي في أنبوب 0.5 مل من أجهزة الطرد المركزي غير لاصقة وتشطف في 10 ملي العازلة الفوسفات وكلوريد الصوديوم 300 ملم ، ودرجة الحموضة 7.4. وأضيف الحمض النووي thiolated في "نهاية (مع وجود فاصل في 10 تي 5" في نهاية 5) في نهائي تركيز قدرها 0.4 ميكرومتر إلى الأسلاك. وكان vortexed العينة لمدة 30 دقيقة ثم تشطف وبواسطة الطرد المركزي (8100 غرام) ثلاث مرات مع العازلة ملي الفوسفات 10 و 300 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4 وثلاث مرات مع 50 ملي العازلة الفوسفات ، و 5 ملي MgCl ₂ ، ودرجة الحموضة 7.2. وكان معلق الأسلاك المغلفة الحمض النووي في 100 ميكرولتر عازلة لتخفيف بمقدار النصف.

وأعدت الحمض النووي derivatized AuNPs بإضافة 50 ميكرولتر 100 مم 2 aptamer ^{الثانية} (مع وجود فاصل من تي 10 في نهاية 5' -) إلى 1 مل AuNPs نانومتر 50 و ساخنة في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. التالية التدفئة ، كان 10 فوسفات الصوديوم العازلة مم ، 1M كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.4 المضافة (25 ميكرولتر مرتين ، تليها 100 ميكرولتر ، ميكرولتر 150 ، وميكرولتر 128) ساعة على فترات 0.5. تركت تقارن على كتلة ° 37 C الحرارة خلال الليل قبل الاستخدام. وتشطف العينات 3 مرات مع 50 ملي العازلة الفوسفات ، و 5 ملي MgCl ₂ ، ودرجة الحموضة 7.2. وتقارن معلق في 120 ميكرولتر العازلة.

تهجين شطيرة على NWS

أضيفت الأسلاك المغلفة الحمض النووي ، 1 ميكرولتر الواحد ، لأنابيب العازلة في PCR. وأضاف S100B البروتين أو البروتين HtrA1 التحكم (1 ميكروغرام / ميكرولتر) لتركيز النهائي من 1 ميكرومتر في 50 ميكرولتر العازلة (~ جزيئات البروتين 10-12 نانومتر المضافة لكل متر مربع من سطح أسلاك متناهية الصغر الاتحاد الافريقي). وكانت العينات لساعات vortexed 2 ~. وتشطف الأسلاك بواسطة الطرد المركزي (8100 غرام) ثلاث مرات مع 50 ملي العازلة الفوسفات ، و 5 ملي MgCl ₂ ، ودرجة الحموضة 7.2 وكان كل منهما معلق في 20 تقارن AuNP / ميكرولتر الحمض النووي. وvortexed الأسلاك في تقارن لمدة 2 ساعة ، ثم تشطف و5X بواسطة الطرد المركزي (1300 ز) مع 50 ملي العازلة الفوسفات ، و 5 ملي MgCl ₂ ، ودرجة الحموضة 7.2 لإزالة جزيئات الزائدة. وكان معلق في العينات20 ميكرولتر العازلة على رقائق مجففة والاتحاد الافريقي سي المغلفة للFE - SEM التحليل.

تم الحصول على FE - SEM صورا لأسلاك باستخدام الانبعاث الضوئي 1530 ليو الميدانية مجهر إلكترون باستخدام مصدر شوتكي الإلكترون الانبعاثات في مجال الجهد التشغيل 5.00 كيلو فولت.

4. ممثل النتائج

الشكل 1. التمهيدي 5' - خالية (PF ₁₎ والتمهيدي الحرة (PF ₂₎ البروتوكولات.

(A) وبروتوكول PF ₁ اختيار الحمض النووي aptamer. هي في صلب [أليغنوكليوتيد] المكتبة معا ، وتعرض لتضخيم PCR لانتاج مكتبة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (أ). مستعدة 5' نهاية التمهيدي خالية (PF ₁₎ منطقة عشوائية من المكتبات PF الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل Nt.BstNBI / Nt.BbvCI الهضم (وتتميز المواقع تشطر مع السهام الحمراء) ، والتنقيات هلام ، والذات معزول الجسر (أسود السهم) التي تنقية هلام (ب). بعد الاختيار (ج) ، يتم تحديد تسلسل المهجنة (المسمى pS30 - CC) مع oligomers يناظرها والذات وligated جسر لإعادة إنشاء مناطق التمهيدي إزالة سابقا. في هذه المرحلة ، يتم إدخال أجهزة الاشعال التي تحتوي على مروج SP6 في نهاية 3' - (د). ثم يتم استخدام هذا الحمض النووي الريبي لكتابة تحتوي على مناطق مختارة (ه). أخيرا ، RNA ومن ثم إعادة تضخيم حصرا (هضم الحمض النووي القالب) باستخدام RT - PCR (و) ، ومكتبة فرعية مختارة ، على استعداد للجولة القادمة من التحديد.

(ب) وبروتوكول PF ₂ اختيار الحمض النووي aptamer. هي في صلب [أليغنوكليوتيد] المكتبة معا ، ويتعرضون لتضخيم PCR لانتاج مكتبة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (أ). مستعدة للمنطقة خالية من التمهيدي (PF ₂₎ عشوائية من مكتبة PF الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل Nt.BstNBI / BspMI الهضم (ويرمز مواقع قطع مع السهام) ، وتنقية هلام. معزول الذاتي الجسر سواء من البروتوكول ₁ PF و / أو عن طريق الهضم ، واحد من المكتبة بدءا Nt.BstNBI (ب) ، إلى جانب تنقية هلام. بعد الاختيار (ج) ، يتم تحديد تسلسل المهجنة (المسمى pS30) مع oligomers يناظرها والذات الجسر ، وligated لتجديد المناطق التمهيدي إزالة سابقا. كما في PF ₁ ، يتم عرض الاشعال التي تحتوي على مروج SP6 في نهاية 3' (د). ثم يتم استخدام هذا الحمض النووي الريبي لكتابة تحتوي على مناطق مختارة (ه). ثم هو حصرا باستخدام الحمض النووي الريبي reamplified RT - PCR (و) ، ومكتبة فرعية مختارة مستعد للجولة المقبلة من التحديد.

الشكل 2. التمثيل التخطيطي والنتائج التجريبية / الحد من ممارسة البروتوكول الاختيار PF. الخطوات المعينة تتوافق مع تلك المصورة في الشكل 1. بعد هضم PF المكتبة التي شيدت من قبل PCR (الخطوة أ) مع تقييد endonucleases (كما هو مبين) ، تم فصل المنتجات التي هضمها PAGE على هلام 10 ٪ في ظل ظروف تغيير طبيعة. وتظهر الأجزاء المقابلة التي تم الحصول عليها مع الجبهة الوطنية ₍₁₎ والبروتوكولات PF اختيار ₂ (الخطوة ب). بعد اختيار (الخطوة ج) ، وتهجين للالأبتامرات ملزمة مع oligomers يناظرها والذات الجسر ، وligated لتجديد المناطق التمهيدي إزالة سابقا. في نهاية 3' ، يتم إدخال أجهزة الاشعال التي تحتوي على مروج SP6 في نهاية 3' (د الخطوة) ^(32). الرناوات ف المسمى تم نسخها باستخدام منتجات ligated 1 ، 0.5 ، 0.25 ، 0.125 ميكرولتر من 5 ميكرولتر ردود الفعل ، وكانت مفصولة عن المواد الهلامية PAGE 6 ٪ في ظل ظروف تغيير طبيعة (ه الخطوة). وعولج ثم مع النصوص الدناز لإزالة المناطق غير محدد الحمض النووي عشوائية ، عكس كتب في [كدنا] ، وreamplified ثم لدورات PCR 7 ، 14 ، 21 أو 28. وكانت منتجات منفصلة عن المواد الهلامية PAGE 8 ٪ في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة. 66 جزء الشمالي يمثل المنتج كامل طول تحتوي على تحديد pS30 - CC ومتواليات pS30 وإعادة المضمنة داخل تسلسل 5 'و 3' المرافقة. ويظهر من علامات PhiX174/HinfI الهجرة إلى اليسار (الخطوة و). وشملت الضوابط إغفال الخطوة العكسي (RT) النسخ. ويمكن أن ينظر إليه كمية صغيرة من المنتج في عينات من هذا القبيل في دورة أرقام عالية ، وهذا يفترض ويمكن القضاء عليها كليا مع الثانية (أو لفترات طويلة) خطوة الدناز الهضم.

الشكل 3. ملزمة خصائص الأبتامرات مختارة واستخدامها في شكل المقترنة ساندويتش.
ألف تعتمد على التركيز ³² ف Aptamer ملزم لتحديد دينار كويتي. والأبتامرات 5' نهاية صفت به ز - ³² - P ATP (3000Ci/mmol ، ~ 10 MCI) و T4 كيناز عديد النوكليوتيد (نيو إنجلاند Biolabs) ، وملزمة وامصممة ليالي كما هو موضح.

اقترنت ب أمين 5' - 1 - derivatized الأبتامرات ^الأولى إلى Codelink ميكروأرس. وكان لا بد من البروتين النقي S100B إلى aptamer ^ش 1 ، تشطف الشرائح بدقة ، والتي تحمل علامات AlexaFluor546 كانت متجهة 2 ^{الثانية} aptamer إلى aptamer ^ش 1 : المجمعات S100B. بعد من خلال الشطف ، والإسفار كميا باستخدام ماسح ضوئي ScanArray.

اقترنت جيم 5' - ثيول derivatized الأبتامرات ^ش 1 إلى أسلاك الاتحاد الافريقي باستخدام الكيمياء ثيول القياسية. اقترنت 2 الأبتامرات ^{الثانية} إلى 50 في AuNPs نانومتر بنفس الطريقة. ثم كان لا بد من البروتين النقي S100B (يسار) أو البروتين النقي السيطرة HtrA1 (يمين) الأولى إلى أسلاك derivatized. بعد شامل الشطف ، 2 - 50 aptamer ^{الثانية} كان لا بد لاحقا AuNPs نانومتر إلى 1 - ^ST - aptamer أسلاك متناهية الصغر : المجمعات S100B. بعد من خلال الشطف ، والمجمعات شطيرة تصور ملزمة باستخدام مجال الانبعاثات المجهر الإلكتروني. أشرطة مقياس = 1 ميكرون.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl
HotMaster TAQ DNA Polymerase	5 PRIME
dNTP Mix	Sigma-Aldrich
Acrylamide	Fisher Scientific
UltraPure 10X TBE Buffer	Invitrogen
Ammonium Persulfate	Bio-Rad
TEMED	Fisher Scientific
PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker	Promega Corp.
Ethidium Bromide
α-32P-dCTP
Phenol:ChCl3:IAA	Ambion
NaCl
Ethanol
Restriction Enzymes	New England Biolabs
Urea	Fisher Scientific
Photographic Film	ECE Scientific
PBS	GIBCO, by Life Technologies
CaCl2	GIBCO, by Life Technologies
MgCl2	GIBCO, by Life Technologies
Ni-NTA Agarose Beads	Qiagen
Polypropylene Column	Qiagen
NaHPO4
NaAc
Detroit-551 cells
SK-MEL-31 cells
MEM
TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
Dimethyl Sulfoxide	Promega Corp.
Sp6 RNA Polymerase	Promega Corp.
RNase-Free DNase I	Promega Corp.
RNase Inhibitor	Promega Corp.
SensiScript Reverse Transcriptase	Qiagen
pCR-2.1-TOPO Vector	Invitrogen
DH5α Compotent Cells	Invitrogen
Plasmid Mini Kit	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs
γ-32P-ATP