Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Özet

SELEX protokolleri da rasgele kütüphane bölgeleri kuşatan sabit primer dizilerinden gerektiren bağlı ligandlar, yenilenme gerektiren her hangi seçimin birden fazla mermi, oluşmaktadır. Bu sabit astar dizileri seçim süreci (yanlış pozitif ve negatif) ile karışabilir. Burada bir astar ücretsiz protokol sunuyoruz.

Özet

Aptamers antikorlar ¹ karşılaştırılabilir yakınlık hedefleri bağlamak oldukça yapılandırılmış oligonükleotidler (DNA veya RNA). In vitro seçim sürecinde hedeflerin geniş bir yelpazede tanımak için, küçük moleküller proteinlerin ve diğer ^{makromoleküllerin} 2-4, üstel zenginleştirme (SELEX) Ligandlar Sistematik Evrim denilen aracılığıyla tespit edilir . Aptamers in vivo teşhis ve / veya terapötik uygulamalar için uygun özelliklere sahiptir: iyi özgüllük ve sıhri yanı sıra, kolayca sentezlenir, daha titiz işleme koşullarında hayatta, onlar kötü immünojenik ve onların göreceli olarak küçük boyutu, uyduruk penetrasyon neden olabilir dokular.

Genellikle her iki tarafta ~ 40 nt uzun randomize bölgelerde artı ~ 20 nt sabit astar siteleri ile nükleik asit kütüphaneleri seçili olduğundan standart SELEX süreci ile tespit Aptamers genellikle ~ 80 nükleotidler (nt) oluşmaktadır. Biyoinformatik yaklaşımlar sabit dizileri ⁵ seçim sonra aptamer yapısı önemli ölçüde katkıda yoktur ki rağmen sabit astar dizileri, böylece ~ kütüphane dizilerinin neredeyse% 50 oluşur, ve bu yüzden olumlu veya olumsuz, seçim ^süreci 3 aptamers belirlenmesi tehlikeye atabilir . Bu potansiyel sorunları çözmek için, astar dizileri tamamlayıcı oligonükleotidler tarafından bloke veya SELEX ⁶ turda farklı dizileri yarıda geçiş, ya da 6-9 nt ^{7, 8} kesilmiş edilmiştir edilmiştir. Wen ve Gri ^9, astar ücretsiz genomik SELEX yöntemi tasarlanmış olan astar dizileri seçiminden önce kütüphane tamamen çıkarıldı ve sonra seçilen genomik parçalarının amplifikasyonu izin rejenere olmuştur. Ancak, tekniği istihdam, benzersiz bir genomik kütüphane inşa edilmesi için, sınırlı bir çeşitlilik sahiptir ve seçim turundan sonra, yenilenme, doğrusal bir reamplification adım dayanır. Alternatif olarak, yüksek verim bölümleme kullanarak sabit primer dizilerinden kaynaklanan sorunları aşmak için çabalar PCR ¹⁰ ile ilgili sorunları ile karşılanmaktadır .

Biz SELEX prosedürler önemli ölçüde kolaylaştıran ve etkili bir astar-parazit ^{sorunları 11,} 12 ortadan kaldırır bir astar-free (PF) seçim yöntemi geliştirdik. Protokolleri basit bir şekilde çalışır. Kütüphane merkezi rastgele bölgede gereksiz yan dizileri olmadan saflaştırılmış ve uygun bir hedef (örneğin bir saflaştırılmış protein veya hücre hatları gibi karmaşık bir karışım) bağlıdır. Sonra bağlı dizileri, elde edilen yan dizileri ile bir araya ve seçilen alt-kütüphaneleri oluşturmak için tekrar amplifiye. Bir örnek olarak, burada S100B, melanoma için protein işaretleyici aptamers seçilmiş. Seçim bir kaç tur sonra 10 ^-8 M aralığı, ve biz aptamers sandviç bağlayıcı bir formatta verimli çalışmasını gösteriyor - Cilt testleri 10 ^-7 Kd gösterdi.

Protokol

1. Primer-Ücretsiz Seçim Protokolleri Kısa Tanımı

Çift iplikli DNA kütüphanesi iki primer bölgeleri ile çevrili 30 nt merkezi rastgele bir etki alanı içeren ilgili oligonükleotidler (Şekil 1 ve 2, Bir Adım), PCR kullanılarak inşa edilmiştir. İki biraz farklı "primer-free" (PF) protokolleri geliştirilmiştir. DsDNA kütüphanesinde, 5'-bölge endonükleaz Nt.BstNBI bir endonükleaz "nick" sitesi içerir ve bu enzim dsDNA tanır ama sadece bir iplikçik DNA substrat keser. DsDNA kütüphane 3'-bölge 3'end (PF ₁₎ yanı sıra bir BspMI CC bırakarak dsDNA tanır ama sadece bir iplikçik parçalayarak endonükleaz Nt.BbvCI için başka bir "nick" sitesi, hiçbir ek 3 'nükleotidler (PF ₂₎ bırakarak hem ipliklerini parçalayarak endonükleaz kısıtlama site. (Aşağıya bakın, seçim süreci boyunca üretilen ayrı parçaları daha kolay çünkü), ve ardından seçim sonraki tur için _{PF 2} protokol istihdam Biz genellikle başlangıçta _PF 1 protokol istihdam .

32 nt 5'-pN30-CC-3 'parçası (32 +-FRAGMENT belirlenen) ve 30 nt, 5'-pN30 3' parçası (30 +-FRAGMENT belirlenen) sırasıyla Nt.BbvCI / Nt tarafından oluşturulan BstNBI veya dsDNA kütüphane BspMI / Nt.BstNBI bölünme ve jel arıtma. 32 + parçası 3'-sonunda bir CC yanındaki dizisi (PF ₁₎ ile 30 nt rastgele etki alanı içerir. 30 + parçası (PF ₂₎ sadece 30 nt rastgele etki alanı dizisi oluşur . "Self-köprü" 66 - fragman (5 've 3' yan dizileri rastgele N30 bölge içeren) jel arıtma (Nt.BbvCI veya Nt.BstNBI sadece üst "+" iplikçik keser) tarafından elde edildi. Bu öz-köprü PF ₁ protokol doğrudan elde edilen ya da üretilen ve sadece NtBbv.CI veya Nt.BstNBI kütüphane DNA PF ₂ protokol (Şekil 1 ve 2, Adım b) kestikten sonra izole edilebilir. 32 + veya 32 + parçaları parçaları proteinlerin veya hücrelerin bağlamak izin saflaştırılmış proteinler ya da kültür melanom hücrelerinin ile inkübe edildi ve sonra ilişkisiz parçaları (Şekil 1 ve 2, Adım c) uzakta yıkandı. Bağlı veya seçilen parçaları astar bölgelerinde yeniden-üretimi için kullanılmıştır.

Hibridizasyon / ligasyonu tepki olarak, kendi kendine köprü üretildi ve 32 aynı zamanda arındırılmış + ve 30 + parçası arıtma; 5'-sonuna astar kütüphane yapım ve 3'-ucundaki primerler yerini aynı oldu 3'-sonunda ek bir SP6 transkripsiyon organizatörü (Şekil 1 ve 2, Adım d) de yer alan primerler uyan. Hibridizasyon / ligasyonu reaksiyon ürünleri, in vitro RNA transkripsiyonu (Şekil 1 ve 2, Adım e) için kullanılmıştır . RNA transkripsiyonu ardından, bağlanan DNA'lar (seçilmemiş kendini köprü DNA parçası da dahil olmak üzere) müdahale arka plan dizileri kaldırmak için DNaz tarafından sindirilir. Ters transkripsiyon (RT)-PCR verileri astar rejenere ürünlerin verimli bir seçim "yuvarlak" (Şekil 1 ve 2, Adım f) oluşturan reamplified olduğunu göstermiştir. No-RT kontrol PCR yüksek devirli numaraları gösterilen arka plan amplifikasyon ek bir DNaz I sindirim tamamen kaldırılır ve biz rutin olarak istihdam alt kademesi numaraları, sonra saptanabilir değildir.

7 tur seçim sonra, aptamers bağlayıcı özelliği karakterize edilmiştir. Kd 10 ^-7 10 ^-8 M aralığı (Şekil 3). Bağlayıcı tayinlerde, aptamers çeşitli çift S100B proteini farklı sitelere hedef gösteren, katkı bağlanma gösterdi. Bu nedenle floresan etiketli ikinci aptamers kullanarak cam mikroarray'ler (Codelink kaydıraklı), ve her ikisi de 50 nm altın nanoparçacıkların (Şekil 3 AuNPs) ikinci aptamers derivatized altın nanotellerin "sandviç" bağlayıcı deneyleri aptamers çiftleri test. Her iki durumda da, bağlayıcı özgüllüğü yüksek: Codelink mikroarray'ler, sandviç bağlama Kd tespitler katkı bağlayıcı değildi aptamers gözlendi. Derivatized nanotellerin ile hemen hemen hiç olmayan hedef proteinlere bağlanarak ve bireysel sandviç kompleksleri aptamer çiftli AuNPs (Şekil 3) ile görülebilir gözlemledi.

2. Malzemeler

2.1. PF DNA Kütüphane ve Bağlı Fragments Reamplification Üretimi

Pan ve Clawson, 2009; Pan ve arkadaşları, 2008.

2.2. Saf Protein Esaslı Seçim

1. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4
2. 32 + Fragment ve 30 +-FRAGMENT
3. Seçim Buffer (Tuzlu 2.5 mM CaCl _2, 5 mM MgCl ₂ 1X Fosfat Tamponlu, pH 7.4, Gibco)
4. Ni-NTA Agaroz Boncuk (Qiagen)
5. Polipropilen Sütun (Qiagen)
6. Cilt Tampon (50 mM ₂ NaHPO _{4-NaH 2} PO _4, pH7.2, 150 mM NaCl)
7. Ifade edilen, saflaştırılmış Cilt Tampon S100B proteini (5 mg / ml)
8. Fenol: CHCl3: IAA (pH 7.9, Ambion)
9. 3 M NaAc, pH 5.2
10. % 100 ve% 70 Etanol

2.3. TOPO Klonlama ve Seçme dsDNA Kütüphaneleri Sıralama Analizi

1. ^7. turda (ek mermi aptamer bağlama optimizasyonu devam yapılabilir) PCR ürünleri
2. pCR2.1-TOPO Vector (Invitrogen)
3. DH5 Bileşen Hücreler (Invitrogen)
4. Plazmid Mini Kit (Qiagen)
5. M13 ileri astar
6. Informax Vektör NTI (Invitrogen)

2.4. Aptamers Cilt Özellikleri

1. Aptamers ve kontrol oligos (N ₃₀ CC ve N _30, IDT)
2. T4 Polinükleotid Kinaz (New England Biolabs)
3. ^γ-32 P-ATP (3000 Ci / mmol 10 μCi / ml)
4. Cilt Tampon Saflaştırılmış S100B (5 mg / ml)

2.5. Saf S100B protein ve Seçilmiş Aptamers Sandviç Cilt Tahliller

1. ^1. aptamer Codelink mikroarray slayt veya b.) Au nanotellerin) a. ya akuple.
2. Saflaştırılmış S100B için 70 ul 0.125 mcM ya seyreltilir protein) veya b 50 ul 1 mcM).
3. Aptamer ya a. etiketli ^2.) Codelink dizi slaytlar için Alexafluor 546, veya b.) derivatized Au nanotellerin çalışmalar için 50 nm AuNPs.

3. Yöntemleri

3.1. PF DNA Kütüphanesi Üretimi

Pan ve arkadaşları, 2008; aptamer seçimi için detaylı Yöntem ve Protokoller Pan ve Clawson, 2009 yılında olabilir.

3.2. Saflaştırılmış S100B Protein kullanarak Aptamer Seçimi

İnsan S100 kalsiyum bağlayıcı protein B (S100B. Gene ID # 6285) bir hedef olarak kullanılmıştır. Onun ₆ etiketli S100B proteini (uzunluğu 98 amino asitler) ifade ve QIAexpressionist sistemini kullanarak arıtılmış oldu. (QIAGEN). Istenen veya Gerektiğinde, O'nun _6-tag enzimatik kaldırılabilir. Tur seçim sırasında, her adımda 1 mcL örnek sıvı sintilasyon genel bağlayıcı etkinliğini belirlemek için sayım kaydedildi.

3.2.1. PF Kütüphane-DNA Fragments hazırlanması

1. 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 40 mcL 32 ⁺ ve 30 ⁺ parçaları yeniden askıya aldı.
2. Isı 3 dakika 85 ° C ve 37 soğumasını ° C, 37 ° C'de bir inkübatör 3 dakika
3. Seçim tampon 760 mcL (Tuzlu 2.5 mM CaCl _2, 5 mM MgCl ₂ 1X Fosfat Tamponlu, pH 7.4, Gibco) ekleyin ve 37 az 3 dakika boyunca inkübe ° C, daha sonra 10 dakika oda sıcaklığında (RT) tutmak.
4. Ön seçim tamponu ile yıkanır, sonra, kullanılıncaya kadar oda sıcaklığında tutmak Ni-NTA agaroz-boncuk (QIAGEN) bulunan bir sütun aracılığıyla iletin.

3.2.2. Ni-NTA Agaroz RT-Boncuk Bağlı S100B hazırlanması

1. 3 sn için Ni-NTA agaroz boncuk 400 mcL Spin ve süpernatantı atın.
2. 400 mcL bağlayıcı tampon (50 mM Na ₂ HPO _{4-NaH 2} PO _4, pH7.2, 150 mM NaCl) yavaşça 5 kez pipetleme, sonra aşağı spin ve süpernatantı atmak boncuk yıkayın.
3. 2. adımı iki kez tekrarlayın.
4. Saflaştırılmış S100B (5 mg / ml, bağlayıcı tampon asılı) 400 mcL ekleyin ve yavaşça 5 kez, toplam 15 dakika için her 3 dakikada bir pipetle.
5. Spin ve süpernatantı atın.
6. 3 kez hafifçe pipetleme bağlayıcı tampon 400 mcL ile boncuk bağlı S100B yıkayın, sonra aşağı spin ve süpernatantı atın.
7. Iki kez 6 adımı yineleyin.

3.2.3. S100B bağlı Aptamers Seçimi

1. Ve 30 - 32 + + parçaları 3.2.1 boncuk bağlı S100B aktarın.
2. 15 dakika boyunca inkübe ve her 3 dakikada hafifçe pipetleme hafifçe karıştırın.
3. Nazikçe pipetleme S100B-DNA kompleksi bağlayıcı tampon 800 mcL ile yıkayın, sonra aşağı spin ve süpernatantı atın.
4. 3. adımı iki kez tekrarlayın.

3.2.4. Kurtarma S100B-Seçilmiş Aptamers

1. 200 mcL 20 mM Tris-HCl (pH7.4), ısı 3 dakika 85 ° C, girdap 1 dakika ekleyin ve aşağı döndürmek, sonra yeni bir tüp süpernatantı aktarın.
2. 1 kez adımı yineleyin ve supernates birleştirmek.
3. 9-12 önceki yayınlar (11, 12) adım başı olarak seçilen DNA parçaları arındırın.

3.2.5. TOPO Klonlama ve Konsensus Aptamer Diziler Kimlik Sıralama Analizi

1. PCR2.1 TOPO vektör (Invitrogen) PCR ürünleri seçilen ^10. turda Clone. Ekdaha fazla seçimleri yapılır klonlama yapılabilir.
2. Sıra 40-50 tek koloniler M13 ileri astar (Hershey Tıp Merkezi Moleküler Genetik Core Tesisi).
3. Informax Vektör NTI (Invitrogen) kullanarak seçilen dizileri hizalayın.
4. Hizalanmalar dayalı konsensus dizileri belirleyin.
5. Konsensus aptamers Integrated DNA Teknolojileri satın alındı.

3.3. Seçilen Aptamers çiftleri Sandviç Cilt Tahliller

3.3.1. Kullanarak Mikroarray formatında floresan ^2. aptamers etiketli.

1. Konsensus 1 ^st Aptamers 5'-amineC6 benzer parçaları ile sentezlenmiştir. Codelink tavsiye protokolleri) 15 mcM final konsantrasyon baskı tampon kapanmıştır ve bir Apogent Keşifler MicroGrid Arrayer DNA Mikroarray tesisi PSU, University Park kullanarak Codelink Aktif Slaytlar (GE Healthcare / Amersham Biosciences) damlatılan. Her slayt 12 dizileri ile basılmıştır.
2. Hibridizasyon 2 x 8 biçiminde Mikroarray Hibridizasyon Kaset (Dizi, TeleChem Uluslararası) gerçekleştirildi. Mikroarray Kaset buharlaşmasını önlemek için nükleaz içermeyen yapışkan sızdırmazlık folyo (AlumaSeal II, Araştırma Ürünler Uluslararası) ile imzalandı.
3. S100B proteini 70 ul uygun konsantrasyonu PBS içinde seyreltilmesi ve mikroarray kasetinin kuyular uygulandı. Codelink slayt üzerinde yazılı olan aptamers bağlama, oda sıcaklığında 1 saat süreyle. Kasetinin kuyular sonra PBS + 5 mM MgCl ₂ (PBSM) ile ayrı ayrı 3X yıkanır, lekelenen ve aşırı yıkama tamponu . 70 ul 0.125 mcM için PBSM sulandırılmış floresan etiketli aptamers ve daha sonra 85 kadar ısıtılır ° C, 3 dakika buz üzerinde takip 3 dakika. Aptamers mikroarray kaset kuyulardan uygulanır ve oda sıcaklığında bir saat süreyle inkübe edildi. Wells PBSM 3X tekrar ayrı ayrı yıkandı. Kaset sonra reklam tüm slayt PBSM durulanır dışında alınmıştır. Slayt sonra iyice santrifüj yoluyla kurutulmuş, ve Tarama Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer) kullanılarak taranabilir.

3.3.2. 50 nm AuNPs akuple ^2. aptamers kullanarak Derivatized Nanotel biçimi

Altın NWS (~ 5 mcM uzunluğu, çapı 320 nm) daha önce yayınlanmış protokolleri (13, 14) gözenekli alümin membranlar içinde galvanostatik elektrodepozisyon tarafından sentezlenen. Gözenekli membran dağılması üzerine, nanotellerin 1 ml etanol içinde yeniden süspanse edildi.

Belirtildiği gibi, DNA Integrated DNA Technologies satın alındı. Altın nanopartiküller Ted Pella (50 nm) satın alındı. Thiolated DNA, bir saat için 0.1 M sodyum fosfat pH 8.3 100 mM DTT ile parçalanır ve daha sonra bir Centri-spin 10 sütunda saflaştırılmış oldu.

Altın NWS ve NPS Aptamer eklenti

Au nanotellerinin 50 mcL kısım 0.5 mL yapışmaz santrifüj tüpüne yerleştirilir ve 10 mM fosfat tamponu, 300 mM NaCl, pH 7.4 içine durulanır. 5 'sonunda (5 10 T spacer' son) thiolated DNA telleri 0.4 mcM son bir konsantrasyonda eklendi. Örnek vortekslenmiş ve 30 dakika sonra 50 mM fosfat tamponu, 5 mM MgCl _2, pH 7,2 10 mM fosfat tamponu, 300 mM NaCl, pH 7.4 ve üç kez santrifüj (8100 gr) tarafından üç kez durulanır. DNA kaplı teller yarı yarıya seyreltilmiş 100 mcL tampon yeniden süspanse edildi.

DNA derivatized AuNPs 1 ml 50 nm AuNPs 50 ul 100 mM ^2. aptamer (sonunda 5'-10 T spacer) ekleyerek ve 37 ısıtılmış ° C'de bir saat süreyle tarafından hazırlanmıştır. Isıtma ardından, 10 mM sodyum fosfat tamponu, 1M NaCl, pH 7.4, 0.5 saatlik aralıklarla (100 mcL, 150 mcL ve 128 mcL 25 mcL iki kez, takip) eklendi. Konjugatları gecede kullanmadan önce 37 ° C ısıya blok kalmıştı. Numuneler 50 mM fosfat tamponu, 5 mM MgCl _2, pH 7,2 ile 3 defa durulanır. Konjugeler 120 mcL tampon yeniden süspanse edildi.

Nws üzerinde Sandviç Hibridizasyon

DNA kaplı teller, sulandırılmış 1 mcL, PCR tüpleri tampon eklendi. 1 mcM 50 mcL tampon (~ 10-12 protein molekülleri Au nanotel yüzey kare nanometre başına eklendi) son bir konsantrasyon için S100B protein veya HtrA1 kontrol protein (1 mcg / ml) eklendi. Örnekler ~ 2 saat vortekslenmiş. Teller 50 mM fosfat tamponu, 5 mM MgCl _2, pH 7,2 santrifüj (8100 gr) tarafından üç kez yıkandıktan sonra ve her 20 mcL AuNP / DNA konjugatları yeniden süspanse edildi. Teller, 2 saat konjugatları vortekslenmiş, ve daha sonra aşırı nanopartiküller kaldırmak için santrifüj (1300 gr) 50 mM fosfat tamponu, ₅ mM MgCl 2, pH 7.2 ile 5x durulanır. Örneklerinde yeniden süspanse edildi20 mcL tampon ve FE-SEM analizi için Au kaplı Si gofret kurutulur.

Nanotellerin FE-SEM görüntüleri, Taramalı Elektron Mikroskobu 5,00 kV işletme gerilimi bir Schottky alan emisyon elektron kaynağı kullanarak bir Leo 1530 Field Emission kullanılarak elde edilmiştir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1. 5'-Primer (PF ₁₎ ve (Primer-PF ₂₎ Protokolleri.

(A) DNA-PF ₁ aptamer seçim protokolü. Kütüphane oligonükleotidler birlikte tavlanmış (a) ve çift iplikli DNA kütüphanesi verim PCR tabi. PF tek iplikli DNA kütüphaneleri 5'-astar-free (PF ₁₎ rasgele bölge Nt.BstNBI / Nt.BbvCI sindirimler (bölünme siteleri, kırmızı ok uçları ile işaretlenmiş) ve jel arındırmalardan tarafından hazırlanan ve kendi kendine -köprü (siyah ok), (b) jel arıtma izole edilmiştir. (C), seçimden sonra seçilen dizileri (pS30-CC tayin) bunlara karşılık gelen oligomerler ve self-köprü ile melezleşmiştir ve daha önce kaldırılan astar bölgelerde yeniden oluşturmak için bağlandı. Bu aşamada, astar 3'-sonunda SP6 promoter (d) içeren tanıtıldı. Bu daha sonra, seçilmiş bölgelerde (e) içeren RNA yazıya kullanılır. Son olarak, RNA, sadece RT-PCR (f) ve seçilen alt-kütüphane (DNA sindirilir) tekrar amplifiye sonraki turda seçim için hazır.

(B) DNA-PF ₂ aptamer seçim protokolü. Kütüphane oligonükleotidler birlikte tavlanmış (a) ve bir çift iplikli DNA kütüphanesi verim PCR tabi tutulur. PF tek iplikli DNA kütüphanesi astar-free (PF ₂₎ rastgele bölge Nt.BstNBI / BspMI sindirimler (kesme siteleri ok uçları ile gösterilir) ve jel arıtma tarafından hazırlanmıştır. Öz-köprü jel arıtma ile birleştiğinde, PF ₁ protokol ve / veya tek sindirim Nt.BstNBI (b) ile başlayan kütüphane tarafından izole edilmiştir. (C), seçimden sonra seçilen dizileri (pS30 tayin) bunlara karşılık gelen oligomerler ve self-köprü ile melezleşmiştir ve daha önce kaldırılmış astar bölgelerde yeniden bağlandı. PF _1, astar 3'-sonunda SP6 promoter (d) içeren tanıtıldı. Bu daha sonra, seçilmiş bölgelerde (e) içeren RNA yazıya kullanılır. RNA daha sonra sadece RT-PCR (f) kullanarak reamplified ve seçilen alt-kütüphane seçimi bir sonraki tur için hazırdır.

Şekil 2. PF seçim protokol uygulama şematik ve deneysel sonuçlar / küçültme Özel adımları Şekil 1'de tasvir karşılık gelir. PCR kısıtlama endonükleaz (belirtildiği gibi) (Bir Adım) tarafından inşa PF kütüphane sindirim sonra, sindirilmiş ürünler denatüre koşullar altında% 10 jel üzerinde SAYFA ayrıldı. PF ₁ ve PF ₂ seçim protokolleri ile elde edilen ilgili parçaları (b Adım) gösterilmiştir. Seçimden sonra (c Adım), bunlara karşılık gelen oligomerler ve self-köprü ile bağlı aptamers melezleşmiştir ve daha önce kaldırılmış astar bölgelerde yeniden bağlandı. 3'-sonunda, ^astar, 32 P-etiketli RNA'lar bağlanan ürünlerin 1, 0.5, 0.25, 5 ul reaksiyonlar 0.125 ul kullanarak notlar alınmıştır. 3'-sonunda SP6 promoter (Adım d) içeren tanıtıldı ve ; denatüre koşulları altında (Adım e)% 6 jeller SAYFA ayrılmış. Transkript sonra seçilmemiş rasgele DNA bölgeleri kaldırıldı DNaz ile tedavi edildi, cDNA içine transkripsiyonu ve sonra 7, 14, 21 veya 28 PCR döngüsü için reamplified ters. Ürünler olmayan denatüre edici koşullar altında% 8 jeller PAGE ile ayrı. 66 nt parçası, 5 've 3' yan dizileri içinde yeniden gömülü olarak seçilen pS30-CC ve pS30 dizileri içeren tam uzunlukta ürünü temsil eder. PhiX174/HinfI belirteçlerinin (Adım f) Göç solda gösterilmektedir. Kontroller ters transkripsiyon (RT) adım ihmal dahildir. Bu tür numunelerin ürün küçük bir miktar yüksek devirli sayılar görülebilir, bu muhtemelen ikinci (ya da uzun süreli) DNaz sindirim adım ile tamamen ortadan kaldırılabilir.

Şekil 3. Seçilen Aptamers ve Sandviç Format Eşleştirilmiş Kullanım bağlayıcı özellikleri.
A. Konsantrasyon Kd Belirlenmesi-Bağımlı ³² P-Aptamer Ciltleme. Aptamers 5'-uç etiketli ^g-32 P-ATP (3000Ci/mmol ~ 10 mCi) ve T4 Polinükleotid Kinaz (New England Biolabs) kullanarak, ve bağlayıcı was olarak açıklanan belirlendi.

B. 5'-amin-derivatized ^1. aptamers mikroarray'ler Codelink akuple edilmiştir. Saflaştırılmış S100B proteini 1 ^st aptamer bağlı, slaytlar iyice durulanır, ve ^2. aptamer 1 ^st aptamer bağlı AlexaFluor546 etiketli: S100B kompleksleri. Durulama yoluyla sonra, Floresans bir ScanArray tarayıcı kullanılarak belirlendi.

C. 5'-tiyol derivatized ^1. aptamers standart tiyol kimya kullanarak Au nanotellerin birleştiğinde. ^2. aptamers Aynı şekilde 50 nm AuNPs birleştiğinde. Saflaştırılmış S100B proteini (sol) veya saflaştırılmış HtrA1 kontrol protein (sağda), daha sonra derivatized nanotellerin ilk yetiyordu. Kapsamlı duruladıktan sonra, 2 ^nci aptamer-50 nm AuNPs, ^daha sonra 1.-aptamer-nanotel bağlı: S100B kompleksleri. Sonra, durulama yoluyla bağlı sandviç kompleksleri alan emisyonlu tarama elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Ölçek bar = 1 mm.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCl
HotMaster TAQ DNA Polymerase	5 PRIME
dNTP Mix	Sigma-Aldrich
Acrylamide	Fisher Scientific
UltraPure 10X TBE Buffer	Invitrogen
Ammonium Persulfate	Bio-Rad
TEMED	Fisher Scientific
PhiX174 DNA/Hinf I DNA Marker	Promega Corp.
Ethidium Bromide
α-32P-dCTP
Phenol:ChCl3:IAA	Ambion
NaCl
Ethanol
Restriction Enzymes	New England Biolabs
Urea	Fisher Scientific
Photographic Film	ECE Scientific
PBS	GIBCO, by Life Technologies
CaCl2	GIBCO, by Life Technologies
MgCl2	GIBCO, by Life Technologies
Ni-NTA Agarose Beads	Qiagen
Polypropylene Column	Qiagen
NaHPO4
NaAc
Detroit-551 cells
SK-MEL-31 cells
MEM
TrypLE Express	GIBCO, by Life Technologies
T4 DNA Ligase	New England Biolabs
Dimethyl Sulfoxide	Promega Corp.
Sp6 RNA Polymerase	Promega Corp.
RNase-Free DNase I	Promega Corp.
RNase Inhibitor	Promega Corp.
SensiScript Reverse Transcriptase	Qiagen
pCR-2.1-TOPO Vector	Invitrogen
DH5α Compotent Cells	Invitrogen
Plasmid Mini Kit	Qiagen
Vector NTI	Invitrogen
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs
γ-32P-ATP