الضغط الجوي التصوير الجزيئي من الأنسجة البيولوجية والأغشية الحيوية التي LAESI طيف الكتلة

Summary

التأين electrospray الليزر التذرية (LAESI) هي مصدر الضغط الجوي ايون لقياس الطيف الكتلي. في وضع التصوير ، ومجسات ليزر تحت الحمراء في منتصف توزيع الجزيئات عبر الباب أو الأنسجة بيوفيلم ملف. هذا الأسلوب يقدم نهجا جديدا للدراسات bioanalytical المتنوعة التي تنفذ في ظل الظروف التجريبية الأصلية.

Abstract

الطرق المحيطة التأين مطياف الكتلة في السماح تنفيذ التحقيقات التحليلية مباشرة على النسيج أو بيوفيلم تحت ظروف تشبه الأم التجريبية. التأين electrospray الليزر التذرية (LAESI) هو أحد هذه التنمية ، وخاصة مناسبة تماما للتحقيق في المياه المحتوية على العينات. LAESI تستخدم شعاع ليزر تحت الحمراء منتصف (2.94 ميكرون الطول الموجي) لإثارة جزيئات الماء من العينة. عندما يتم تجاوز عتبة فلوينس التذرية ، وطردت مادة العينة في شكل جسيمات وهذه المقذوفات السفر لعشرات ملليمتر فوق سطح العينة. في LAESI ، يتم اعتراضها من قبل هذه السحابة قطرات الاجتثاث مشحونة لالتقاط جزء من مادة العينة طرد وتحويل مكوناتها الكيميائية في المرحلة أيونات الغاز. يعمل مطياف الكتلة مجهزة واجهة الغلاف الجوي الأيوني مصدر ضغط على تحليل وتسجيل تكوين أيونات سراح القادمة من منطقة بحث (بكسل) من العينة. استجواب المنهجي على مجموعة من بكسل يفتح الطريق أمام التصوير الجزيئي في تحليل وضع مسبار مجهري. ومن الجوانب الفريدة للتصوير الطيفي الشامل LAESI هو التنميط عمق ذلك ، بالاشتراك مع التصوير الجانبي ، وتمكن ثلاثي الأبعاد (3D) التصوير الجزيئي. مع القرارات الحالية الوحشي وعمق ميكرومتر 100 ~ ~ 40 ميكرون و، على التوالي ، LAESI التصوير الطيفي الشامل يساعد على استكشاف التركيب الجزيئي للالأنسجة البيولوجية. هنا ، علينا إعادة النظر في العناصر الرئيسية للنظام LAESI وتوفير مبادئ توجيهية لإجراء تجربة ناجحة التصوير.

Protocol

بروتوكول التالية توضح الخطوات الرئيسية للelectrospray التأين الليزر التذرية (LAESI) تجربة ويقدم أمثلة ممثل للتصوير (3D) الوحشي وثلاثي الابعاد لصحة الحيوان وعينات الأنسجة النباتية. ويمكن الحصول على تفاصيل إضافية التجريبية والتقنية من أماكن أخرى. ^1-6

1. إعداد وتركيب الأنسجة

1. اذا كانت هناك حاجة sectioning ، استخدم cryomicrotome إلى مقطع إلى شرائح الأنسجة سميكة 1-10 ميكرون في -10 إلى -20 درجة مئوية ما لم خلاف ذلك أوصت لنوع الأنسجة معين.
2. أقسام جبل على سطح مستو (على سبيل المثال ، الشريحة كيميائيا قبل تنظيف الزجاج) مباشرة من دون المعدلات الكيميائية. لأنسجة مقطوع ، أذاب جبل المقاطع وتأمين صاحب العينة للمرحلة التبريد بلتيير فور ذوبان الجليد لتركيب إبقاء الأنسجة المجمدة في جميع الأوقات خلال التحليل. هناك حاجة إلى هذه الخطوة للحد من / منع الهجرة الجزيئية في هذا الباب.
3. إذا لزم الأمر ، واستخدام بالوعة الحرارة مجهزة مروحة الطاقة المنخفضة لتسهيل إزالة الحرارة من المسرح بلتيير للحفاظ على الأنسجة المجمدة.
4. في بيئة رطبة على مدى فترة ممتدة من الوقت (1-2 ساعات) ، وفحص لالتكثيف من الماء أو الجليد على سطح النسيج. تكثيف الماء يؤثر على النسيج ضارا على أداء التصوير في التجارب LAESI ¹
5. إذا لزم الأمر ، واستخدام مزيل الرطوبة غرفة أو مكان العينة في غرفة تبريد البيئية مملوءة بغاز خامل (مثل غاز النيتروجين الجاف) لمنع التكثف ¹

2. الاستفادة المثلى من مصدر ايون LAESI

مصدر ايون LAESI يتكون من الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ، سلسلة من العناصر البصرية لتوجيه الضوء والتركيز فضلا عن أصحاب عينة إضافية ، ومكونات التبريد ، ومراحل الترجمة ونظام التسليم المذيبات. الشكل 1 يوضح الترتيب النموذجي لهذه العناصر فيما يتعلق مدخل مصدر ايون الغلاف الجوي والضغط لمطياف الكتلة.

1. كما هو موضح في الشكل 1 ، ضع عينة 15-20 ملم تحت فوهة لأخذ العينات مطياف الكتلة مخروط (د _{أو FP).}
2. تعمل ليزر الأشعة تحت الحمراء في منتصف الموجة 2.94 ميكرون و 10 هرتز معدل الرسوب. تخفيف الإخراج إلى طاقة الليزر ~ μJ / نبض 100.
3. استخدام مزيج من المرايا الذهب وتركز عدسة شفافة على طول الموجة الليزر (على سبيل المثال ، مقهى ، بلانو عدسة محدبة أو ZnSe ₂₎ لزوجين من الطاقة نبضة ليزر في عينة في حالات طبيعية (انظر زاوية الحق وقوع فيما يتعلق سطح العينة في الشكل 1).
4. موقف محور شعاع منتصف 5-8 ملم تحت الحمراء أمام فتحة أخذ العينات من مخروط مطياف الكتلة.
5. ضبط موضع تركيز العدسة والطاقة نبضة من شعاع الليزر لإزالة أنسجة تحقيق في نقطة بؤرية. أبعاد ablated تحديد حجم بكسل (أو فوكسل في التصوير الثلاثي الابعاد) حجم لتطبيق التصوير.
6. موقف باعث nanospray تماشيا مع محور مدخل مطياف الكتلة ، وعلى مسافة وغيض الفوهة إلى باعث من 10 مم ~ (انظر الشكل 1).
7. لelectrospray ، تجهيز 50 ٪ محلول الميثانول مع حمض الخليك بنسبة 0.1 ٪ أو 0.1 ٪ خلات الأمونيوم المضافة لوضع أيون إيجابية أو سلبية ، على التوالي. اعتمادا على نموذج ، والمذيبات العضوية الأخرى ، مثل الأسيتونيتريل ، الأيزوبروبانول ، وما إلى ذلك ، قد استبدال الميثانول بتركيزات مناسبة للقيام بهذه المهمة التحليلية. استقرار electrospray أمر حاسم لنجاح التصوير. اعتمادا على اختيار المذيبات ، ومعدل التدفق والجهد الرش بحاجة إلى تعديل لتحقيق الرش مستقر.
8. عن رد الفعل LAESI ⁶ في تطبيقات التصوير ، قد حل electrosprayed تحتوي المواد المتفاعلة.
9. استخدام مضخة الحقن لتقديم حل electrospray من خلال باعث electrospray بمعدل تدفق NL 300 ~ / دقيقة.
10. إذا كان يتم الاحتفاظ فوهة مطياف الكتلة في الجهد المنخفض (<500 V تقاس الأرض) ، وتوليد electrospray من خلال تطبيق الجهد العالي مباشرة إلى باعث electrospray (على سبيل المثال ، 3000 V) أو من خلال اتحاد المعادن. خلاف ذلك ، الأرض مباشرة أو من خلال باعث electrospray المعادن لتأسيس اتحاد electrospray.
11. تشغيل مصدر electrospray في شكل مخروط طائرة رش وضع لتوليد أيونات أكثر كفاءة من خلال LAESI. لتأثير المتغيرات التي تعمل على وسائل الرش وتأثيرها على أطياف الشامل ، انظر المناقشات في مكان آخر. ^5،7،8
12. ضبط المسافات بدقة نسبية من الإعداد الأمثل لLAESI العائد ايون LAESI مع الحفاظ على شعاع الليزر ، وباعث ، ومحاور فتحة في الطائرة نفسها. يرجى العثور على تعليمات مفصلة في مكان آخر. ⁵
13. مع المجهر الضوئي ، وتحديد أبعاد الوحشي من الحفرة الاجتثاث على العينة.
14. لمدة ثلاثة الابعاد تجارب التصوير LAESI ، نفذ الاجتثاث مع نبضات فردية وتحديد عمق فوكسل به ، على سبيل المثال ، وضع ض المكدس في المجهر الضوئي. ³

3. التصوير الجزيئي وتحليل البيانات

في التجربة والتصوير ، ويتم نقل عينات الأنسجة في الطائرة البؤرية ليزر في اتجاهات X و Y مع أحجام أكبر من خطوة أو مساوية لأبعاد المكان الاجتثاث. يقتصر القرار المكانية التي تركز الحادث شعاع الليزر.

1. حدد مجال الاهتمام على سطح العينة ، والحصول على (X ، Y) إحداثيات الحدود المناظرة.
2. اختار خوارزمية gridding (على سبيل المثال ، على التكيف الشبكة ، وتحديد منطقة التصوير ، والشبكة مستطيلة ، ولبي ، Z المسح الضوئي ، الخ) التي لالنقطية سطح العينة المختارة مع الوقت يسكن في كل بكسل على المنطقة المراد تصويره.
3. استخدام مرحلة الترجمة ثلاثة محاور وبرامج قادرة على rastering العينة وفقا لشبكة محددة سلفا.
4. حساب الوقت الإجمالي المطلوب للتصوير.
5. تعطيل الوقت اكتساب الحد بيانات مطياف الكتلة. إذا كان هذا غير ممكن ، تعيين وقت اقتناء البيانات للحد من قيمة التصوير الوقت محسوب.
6. بدء مصدر ليزر الأشعة تحت الحمراء في منتصف معدل التكرار المناسبة لانتاج ما يكفي من الإشارات إلى نسبة الضوضاء في الطيف الشامل في غضون الوقت يسكن في كل بكسل لإجراء تجربة التصوير LAESI الجانبية. للتصوير الجزيئي 3D ، استخدام معدل اقتناء الطيف أعلى من معدل تكرار الليزر المصدر إلى بنجاح الشامل تحليل الأيونات المتولدة داخل نبضة ليزر واحد. تنتظر إشارة البدء لبدء تسلسل الاجتثاث.
7. بدوره على مصدر electrospray. تأكد من أن هناك حلا كافيا للمرة الكامل اللازم للتصوير.
8. ستارت واحد الحصول على أطياف الشامل ، والتذرية الليزر منتصف الأشعة تحت الحمراء ، ومسح السطح.
9. عندما انتهى التصوير تشغيل ، إيقاف مسح السطح ، وlasing منتصف الأشعة تحت الحمراء ، والحصول على البيانات.
10. تعطيل مصدر الليزر.
11. إيقاف الجهد العالي.
12. إيقاف ضخ حقنة.
13. تعيين مطياف الكتلة إلى وضع الاستعداد.
14. إيقاف الالكترونيات بلتيير التبريد.
15. إغلاق خامل تدفق الغاز في حالة استخدامها.
16. استخدام برمجيات لربط الإحداثيات المطلقة من بكسل في التصوير الجانبي أو في التحليل وvoxels 3D مع الأطياف المقابلة.
17. رسم إشارة كثافة الأيونات لقيمة م / ض مختارة ضد الإحداثيات المطلقة للتحليل الجزيئي للحصول على صور الوحشية و 3D.

4. ممثل النتائج

الشكل 2 يعطي نتائج ممثل لبعض أنواع الأنسجة الرئيسية وطرائق التصوير. لوحة ويصور الحال بالنسبة لحيوان القسم الأنسجة التي جمدت خلال التجربة لمنع الجفاف. ⁽¹⁾ وبالإضافة إلى ذلك ، تم وضع العينة في بيئة النيتروجين الغاز الجاف لتجنب أبخرة المياه المحيطة من تكاثف على سطح العينة. تم تصوير قسم أفقيا 100 ميكرون سميكة الاكليلية من دماغ فأر (الجرذ النرويجي) مع LAESI. المناطق التشريحية للدماغ (انظر الصورة البصرية في لوحة أ) تبين علاقة جيدة مع الصور التي تم الحصول عليها الجزيئية للكمبيوتر plasmalogens (O - 33 : 3) و / أو PE (O - 36 : 3) مع م / ض 728.559.

لوحة باء يظهر التصوير LAESI 3D محطة زيبرا (Aphelandra squarrosa) أنسجة نبات. لأن يترك تمتلك آلية دفاعية طبيعية ضد الجفاف ، يمكن استجوابه العينة في البيئة المحيطة. ⁽³⁾ الحصول على صور الجزيئية 3D كشفت مجموعة متنوعة من أنماط التوزيع للالأيضات الابتدائية والثانوية. من بين أمور أخرى ، تم الكشف عن acacetin مع م / ض 285.076 في تعداد أعلى ايون في القطاعات الصفراء من طبقات الثانية والثالثة من أعلى مع توزيع متجانس في الآخرين. وافق هذا التوزيع مع نمط وتلون ينظر في الصورة الضوئية.

الشكل 1. التخطيطي للنظام LAESI (ES ، electrospray غيض باعث ، أو ، من فوهة مطياف الكتلة مخروط أخذ العينات ؛ FL ، تركز العدسة ؛ FP ، نقطة محورية ؛ P ، بلتيير التبريد المرحلة ؛ HS ، بالوعة الحرارة). جزء من الجسيمات طرد خلال منتصف IR الاجتثاث (النقط الحمراء) coalesces مع electrospray لانتاج قطرات اتهم المصنف مع الجزيئات والأيونات من العينة (نقطة خضراء). ويتم تحليل الأيونات المفرج عنهم من هذه القطرات والتي سجلتها في مطياف الكتلة.

الشكل 2. ممثل عن النتائج imagi الوحشي و 3D. نانوغرام مع LAESI الطيف الكتلي (A) لوحة تصور أعلى الصورة البصرية للدماغ فأر (الجرذ النرويجي) القسم الاكليلية والحصول على صورة الجزيئية للكمبيوتر plasmalogens (O - 33 : 3) و / أو PE (O - 36 : 3) مع م / ض 728.559. شريط أبيض على نطاق يناظر 1 ملم. تكييفها مع إذن من (المرجع ^1). حقوق الطبع والنشر 2010 الجمعية الكيميائية الأمريكية. (ب) لوحة أسفل يظهر التصوير 3D من ورقة من نبات زيبرا المتنوعة (Aphelandra squarrosa). تم الكشف عن Acacetin مع م / ض 285.076 في تعداد أعلى ايون في القطاعات الصفراء من طبقات الثانية والثالثة من أعلى مع توزيع متجانس في الآخرين. طبع بإذن من (المرجع ^3). حقوق الطبع والنشر 2009 جمعية الكيميائية الاميركية.

Discussion

أنواع الأنسجة المختلفة المعرض متفاوتة المحتوى المائي وقوة الشد ، والتي ، بدورها ، يمكن أن تؤثر على الخصائص الاجتثاث من العينات. ⁹ وللتخفيف من هذه الآثار ، من المرغوب فيه أن يعاد النظر في فلوينس الليزر ، والتعامل مع العينة ، وتحليل بروتوكولات عند تغيير بين أنواع الأنسجة الرئيسية.

لخلية واحدة أو التحقيقات أعلى القرار ، يمكن أن يقترن ضوء الأشعة تحت الحمراء في منتصف الألياف البصرية بدلا من شحذ عدسة التركيز. ^{10 من} خلال تحديد المواقع غيض من الألياف مقربة من الخلايا المحددة في الأنسجة ، يمكن إجراء تحليل على LAESI مستوى وحيدة الخلية.

كتسمية خالية من مصدر لايون المحيطة التأين مطياف الكتلة ، فقد أظهرت ¹¹ LAESI امكانات كبيرة للتحقيق في العمليات الكيميائية الحيوية في الأنسجة. مع فوائد إضافية من التحليل المباشر ، والتصوير الأفقي و 3D ، LAESI أداة الناشئة عن التنميط bioanalytical فضلا عن تطبيقات التصوير.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR