בלחץ אטמוספרי מולקולרית והדמיה של רקמות ביולוגיות באמצעות Biofilms LAESI המוניים ספקטרומטריית

Summary

Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא מקור של לחץ אטמוספרי יון עבור ספקטרומטריית מסה. במצב הדמיה, אמצע אינפרא אדום בדיקות הלייזר הפצות של מולקולות על פני קטע רקמה או biofilm. טכניקה זו מציגה גישה חדשה ללימודי bioanalytical מגוונים שבוצעו תחת תנאים ניסויים הילידים.

Abstract

שיטות יינון אמביינט ב ספקטרומטריית מסה לאפשר חקירות אנליטית להתבצע ישירות על רקמות או biofilm תחת הילידים כמו תנאי הניסוי. Electrospray לייזר אבלציה יינון (LAESI) הוא אחד התפתחות כזו היא בעיקר מתאים היטב החקירה של מים המכילים דגימות. LAESI מנצל קרן אמצע לייזר אינפרא אדום (אורך גל 2.94 מיקרומטר) כדי להלהיב את מולקולות המים של המדגם. כאשר סף השטף אבלציה חריגה, החומר המדגם הוא גורש בצורה של חומר חלקיקי וקלעים אלה לנסוע עשרות מילימטרים מעל פני השטח מדגם. ב LAESI, פלומה זו אבלציה הוא יורט על ידי טיפות טעון ללכוד שבריר של החומר מדגם נפלט להמיר מרכיבים כימיים שלה לגז שלב יונים. ספקטרומטר מסה מצויד בממשק בלחץ אטמוספרי מקור יון מועסק לנתח ולתעד את ההרכב של יוני שוחרר שמקורם באזור נחקר (פיקסל) של המדגם. חקירה שיטתית על מערך של פיקסלים פותחת דרך הדמיה מולקולרית במצב ניתוח microprobe. היבט ייחודי של הדמיה המוני LAESI spectrometric הוא פרופיל עומק, בשילוב עם הדמיה לרוחב, מאפשר תלת ממדי (3D) הדמיה מולקולרית. עם החלטות לרוחב ועומק הנוכחי של ~ ~ 100 מיקרומטר ו 40 מיקרומטר, בהתאמה, הדמיה LAESI מסה spectrometric מסייעת לחקור את המבנה המולקולרי של רקמות ביולוגיות. במסמך זה, נסקור את האלמנטים העיקריים של מערכת LAESI ולספק הנחיות ניסוי הדמיה מוצלחת.

Protocol

הפרוטוקול שלהלן מתארת ​​את השלבים העיקריים של יינון אבלציה electrospray לייזר (LAESI) ניסוי ומספק דוגמאות מייצגות עבור דימות (3D) בצירי תלת ממדי עבור בעלי חיים דגימות רקמות הצמח. פרטים ניסיוניים טכני נוסף ניתן לקבל במקום אחר. ^1-6

1. רקמות הכנה הרכבה

1. אם חתך נדרש, השתמש cryomicrotome סעיף הרקמה לתוך 1-10 פרוסות עבות מיקרומטר ב -10 עד -20 ° C אלא אם מומלץ אחרת לסוג רקמה מסוימת.
2. הר חלקים על גבי משטח שטוח (למשל, ניקוי כימי קדם שקופיות זכוכית) ישירות ללא מכפילי כימיים. עבור רקמות מחולק, להפשיר-Mount בסעיפים ומאובטח בעל מדגם לשלב Peltier קירור מיד עם ההפשרה הרכבה כדי לשמור על הרקמה הקפואה בכל עת במהלך ניתוח. צעד זה נחוץ כדי למזער / למנוע הגירה מולקולרית בסעיף.
3. במידת הצורך, להשתמש מפזר החום מצויד מאוורר צריכת חשמל נמוכה כדי להקל על הסרת חום מהשלב-Peltier כדי לשמור על הרקמה הקפואה.
4. בסביבה לחה על פני תקופה ממושכת של זמן (1-2 שעות), לבדוק את התעבות של מים או קרח על פני השטח רקמות. עיבוי מים על הרקמה לרעה משפיע על הביצועים הדמיה בניסויים LAESI ^1.
5. במידת הצורך, להשתמש במסיר לחות בחדר או במקום מקורר מדגם בתא סביבתי מלא גז אינרטי (גז למשל, חנקן יבש) כדי למנוע התעבות. ¹

2. אופטימיזציה של מקור יון LAESI

מקור יון LAESI מורכב לייזר אמצע אינפרא אדום, סדרה של אלמנטים אופטיים עבור היגוי אור ומיקוד כמו גם מחזיקי מדגם נוסף, רכיבי קירור, בשלבי תרגום, מערכת המסירה ממס. איור 1 מדגים את הסדר אופייני של רכיבים אלה ביחס לכניסה של מקור הלחץ האטמוספרי, יון של ספקטרומטר מסה.

1. כפי שמודגם באיור 1, העמדה מ"מ מדגם 15-20 להלן פתח של קונוס ספקטרומטר מסה דגימה (ד _OR-FP).
2. Operate לייזר אמצע IR באורך גל 2.94 מיקרומטר ו 10 הרץ שיעור החזרה. להחליש את פלט לייזר אנרגיה ~ μJ / דופק 100.
3. השתמש בשילוב של מראות זהב עדשה תוך התמקדות שקוף על אורך גל לייזר (למשל, Plano-קמור קפה ₂ או ZnSe העדשה) לזוג הדופק לייזר אנרגיה לתוך המדגם על שכיחות נורמלי (ראה זווית שכיחות נכון לגבי השטח מדגם באיור 1).
4. מקם את אמצע אינפרא אדום ציר הקורה 5-8 מ"מ מול פתח של קונוס ספקטרומטר מסה הדגימה.
5. לשנות את מיקום העדשה למקד את האנרגיה ואת הדופק של קרן הלייזר כדי להשיג את הסרת רקמת במקום מוקד. מידות נפח ablated לקבוע את פיקסל (או voxel הדמיה תלת ממדי) בגודל של היישום הדמיה.
6. מיקום פולט nanospray בקו אחד עם ציר כניסה של ספקטרומטר מסה במרחק פתח אל פולט קצה ~ 10 מ"מ (ראה איור 1).
7. עבור electrospray, להכין פתרון מתנול 50% עם חומצה אצטית 0.1% או 0.1% אמוניום אצטט תוסף עבור מצב יון חיובי או שלילי, בהתאמה. בהתאם המדגם, ממסים אורגניים אחרים, כגון אצטוניטריל, isopropanol וכו ', ניתן להחליף מתנול בריכוזים המתאימים למשימה אנליטית. יציבות electrospray הוא קריטי עבור הדמיה מוצלחת. בהתאם לבחירת ממס, את קצב הזרימה ואת מתח הריסוס צריך להיות מותאם על מנת להשיג תרסיס יציב.
8. עבור תגובתי LAESI ⁶ יישומי הדמיה, הפתרון electrosprayed עשוי להכיל המגיבים.
9. השתמש משאבת מזרק כדי לספק את הפתרון electrospray דרך פולט electrospray בקצב הזרימה של ~ 300 NL / min.
10. אם פתח ספקטרומטר מסה הוא שמר על מתח נמוך (<500 V נמדד כנגד הקרקע), ליצור electrospray על ידי יישום מתח גבוה ישירות פולט electrospray (למשל, 3000 V) או באמצעות איגוד מתכת. אחרת, הקרקע ישירות את emitter electrospray או באמצעות איגוד מתכת להקים electrospray.
11. הפעל את מקור electrospray ב סילון קונוס ריסוס במצב לדור יון היעילה ביותר על ידי LAESI. ההשפעה של משתנים הפועלים על מצבי ריסוס והשפעתם על ספקטרום המוני, ראה דיונים אחרים. ^5,7,8
12. בזהירות להתאים את המרחקים היחסית של ההתקנה LAESI לבצע אופטימיזציה עבור תשואה יון LAESI תוך שמירה על קרן לייזר, את emitter ואת צירי פתח באותו המטוס. בבקשה למצוא הוראות מפורטות במקום אחר. ⁵
13. עם מיקרוסקופ אופטי, לקבוע את ממדי רוחבית של המכתש אבלציה על המדגם.
14. במשך שלושה ממדי ניסויים LAESI הדמיה, לבצע אבלציה עם פולסים הפרט לקבוע את עומק voxel באמצעות, לדוגמה, את מצב Z-המחסנית מיקרוסקופיה אופטית. ³

3. הדמיה מולקולרית ניתוח נתונים

בניסוי הדמיה, דגימה הרקמה מועברת במישור המוקד של הלייזר בכיוונים X ו-Y עם גודל צעד גדול או שווה ל מימדי במקום אבלציה. ההחלטה מרחבית מוגבלת על ידי מיקוד של קרן לייזר האירוע.

1. בחר את שטח של עניין על פני השטח מדגם להשיג את (X, Y) הקואורדינטות של גבולות המקביל.
2. בחרו אלגוריתם gridding (למשל, רשת אדפטיבית, הדמיה האזור הנבחר, ברשת מלבנית, תבנית ספירלה, Z סריקה וכו ') שבה אל פני השטח מדגם סריקה עם נבחרת זמן להתעכב על כל פיקסל על השטח להיות צילמו.
3. השתמש שלב שלוש ציר תרגום תוכנה המסוגלת rastering המדגם לפי לרשת מראש.
4. חשב את הזמן הכולל הנדרש עבור הדמיה.
5. השבת את רכישת נתונים מגבלה של זמן ספקטרומטר מסה. אם הדבר אינו אפשרי, להגדיר את רכישת נתונים בזמן גבול ערך מחושב זמן הדמיה.
6. הפעל את מקור אמצע לייזר אינפרא אדום בשיעור החזרה נכונה כדי לייצר מספיק יחס אות לרעש בספקטרום המונית תוך זמן להתעכב ליד כל פיקסל לבצע ניסוי LAESI הדמיה לרוחב. עבור הדמיה מולקולרית 3D, השתמש לרכישת ספקטרום שיעור גבוה יותר מאשר שיעור החזרה למקור הלייזר בהצלחה המוני לנתח את היונים שנוצר בתוך הדופק לייזר יחיד. חכו האות להתחיל ליזום את רצף אבלציה.
7. הפעל את מקור electrospray. ודא כי קיים פתרון מספיק בפעם מלא נדרש הדמיה.
8. במקביל START רכישת ספקטרום המונית, אבלציה אמצע IR לייזר, סריקה משטח.
9. כאשר לרוץ הדמיה סיימה, להפסיק את סריקת השטח, lasing אמצע IR, ורכישת נתונים.
10. השבת את מקור הלייזר.
11. כבה את מתח גבוה.
12. כבה את משאבת מזרק.
13. הגדר את ספקטרומטר מסה למצב המתנה.
14. כבה את Peltier קירור האלקטרוניקה.
15. סגור זרימת גז אינרטי אם נעשה שימוש.
16. השתמש בתוכנה כדי לתאם את הקואורדינטות המוחלט של פיקסלים לרוחב או הדמיה voxels בניתוח 3D עם ספקטרום המקביל.
17. מגרש את עוצמת האות יון ערך m / z שנבחר נגד מתאמת המוחלט של ניתוח כדי להשיג תמונות מולקולרית לרוחב ו 3D.

4. נציג תוצאות

איור 2 נותן תוצאות נציג כמה סוגי רקמות הגדולות שיטות הדמיה. לוח מתאר מקרה של מקטע רקמה חיה כי הוקפאה במהלך הניסוי על מנת למנוע התייבשות. ¹ בנוסף, המדגם נמצא בסביבה יבשה גז חנקן כדי למנוע אדי מים מן הסביבה עיבוי על פני השטח מדגם. סעיף 100 מיקרומטר בעובי העטרה במוח חולדה (Rattus norvegicus) היה הדמיה רוחבית עם LAESI. האזורים האנטומיים של המוח (ראה תמונה אופטי בלוח) מראים קורלציה טובה עם התמונה מולקולרית השיג עבור ה-PC plasmalogens (O-33: 3) ו / או PE (O-36: 3) עם m / z 728.559.

לוח ב 'מראה את 3D הדמיה LAESI מפעל זברה (Aphelandra squarrosa) רקמת העלה. בגלל העלים בעלי מנגנון הגנה טבעי מפני התייבשות, המדגם יכול להיות נחקר בסביבה הסביבה. ³ התמונות שהתקבלו מולקולרית 3D חשף מגוון של דפוסי התפוצה של מטבוליטים ראשוניים ומשניים. בין היתר, acacetin עם m / z 285.076 זוהה על ספירת יון גבוה יותר במגזרים צהוב של שכבות השני והשלישי מלמעלה עם חלוקה הומוגנית של האחרים. התפלגות זו הסכים עם דפוס של ססגון לראות תמונה אופטי.

באיור 1. סכמטי של מערכת LAESI (ES, טיפ electrospray פולט, או, פתח חרוט ספקטרומטר מסה הדגימה, פלורידה, תוך התמקדות העדשה; FP, נקודת מוקד, P, בשלב Peltier הקירור; HS, מפזר החום). חלק מן החומר חלקיקי גורשו במהלך אבלציה אמצע IR (נקודות אדומות), מתמזגת עם electrospray להניב טיפות טעונה seeded עם מולקולות ויונים של המדגם (נקודות ירוקות). יוני שוחרר מבית טיפות אלה נותחו נרשמו על ידי ספקטרומטר מסה.

איור 2. תוצאות עבור נציג Imagi לרוחב ו 3D. ng עם LAESI ספקטרומטריית מסה (A) הפאנל העליון מתאר את התמונה האופטי במוח חולדה (Rattus norvegicus) סעיף העטרה ואת התמונה מולקולרית השיג עבור ה-PC plasmalogens (O-33: 3) ו / או PE (O-36 : 3) עם m / z 728.559. סרגל סולם לבן מתאים מ"מ 1. עיבוד באישור (Reference ^1). כל הזכויות שמורות 2010 האגודה האמריקנית לכימיה. (ב) פאנל התחתונה מציגה הדמיה 3D של עלה מתוך מגוון זברה צמח (Aphelandra squarrosa). Acacetin עם m / z 285.076 זוהה על ספירת יון גבוה יותר במגזרים צהוב של שכבות השני והשלישי מלמעלה עם חלוקה הומוגנית של האחרים. התפרסם באישור (Reference ^3). כל הזכויות שמורות 2009 האגודה האמריקנית לכימיה.

Discussion

סוגי רקמות שונות התערוכה תוכן משתנה מים חוזק מתיחה, אשר, בתורם, יכולים להשפיע על מאפייני אבלציה של הדגימות. ⁹ כדי לצמצם את ההשפעות הללו, הוא הרצוי כי הפרוטוקולים השטף לייזר, טיפול מדגם, וניתוח להיות מתוקן כאשר משתנה בין רקמה סוגים עיקריים.

עבור תא יחיד או חקירות רזולוציה גבוהה יותר, האור אמצע אינפרא אדום ניתן בשילוב לתוך סיב אופטי מחודד במקום העדשה מתמקדת. ¹⁰ מאת מיקום קצה סיב בתוך בסמיכות של התאים הנבחרים ברקמות, ניתוח LAESI יכול להתבצע על רמת מתחיל מתא בודד.

כמקור-תווית חינם יון עבור ספקטרומטריית יינון הסביבה המונית, ¹¹ LAESI הראו פוטנציאל גדול חקירה של תהליכים ביוכימיים ברקמות. עם היתרונות של ניתוח ישיר הוסיף, ההדמיה לרוחב ו 3D, LAESI הוא כלי bioanalytical המתעוררים פרופיל, כמו גם יישומי הדמיה.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR